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马铃薯(Solanum tuberosum)是世界上四种主要的粮食作物之一,但它受到青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的侵染,质量和产量严重为害。研究和挖掘马铃薯防御基因的功能有助于相关的抗病实践。NAC基因家族是植物转录调控因子的主要家族之一,具有多种功能,大部分的NAC TF都与植物的生长发育和应对生物或非生物胁迫有关。前期在马铃薯对抗青枯病防御机制的研究中发现了转录因子NAC可能参与抗病,基于此,本文利用RACE方法克隆了一条马铃薯NAC基因(StNACb4),利用相关软件及在线服务器对该基因进行结构分析,并用青枯菌诱导和植物激素处理马铃薯幼苗,进行该基因及抗病标志基因StPR10的表达特征分析;继而通过在烟草中进行病毒诱导的同源基因沉默(VIGS Nb NACb4)和过表达转StNACb4基因验证其对青枯菌的耐受情况,通过观察其接种后的病害症状、超敏反应细胞死亡以及胼胝质的沉积情况等进行功能验证。结果如下:(1)利用生物信息学分析得出,该基因长度为864 bp,开放阅读框为705 bp,编码235个氨基酸的NAC类转录因子,包含一个典型的NAM superfamily保守结构域。StNACb4蛋白亚细胞定位于细胞核中,无跨膜区,为稳定的亲水性蛋白。系统进化分析表明StNACb4蛋白与茄科同源NAC关系较近。该基因启动子区域中预测出多种应答植物激素信号通路和防御应激反应的顺式作用元件,推断StNACb4参与植物激素信号通路和防御应激反应。(2)利用RT-qPCR方法鉴定StNACb4基因受青枯菌和不同外源激素如水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸在不同时间点的转录表达特征,结果表明,StNACb4基因受青枯菌诱导而快速激活表达,维持马铃薯对病原菌的耐受性。同时StNACb4基因也受一定浓度的外源植物激素的诱导表达,并维持一定时长的持续效应。显示该基因参与了马铃薯青枯病抗性且受到植物激素信号相关的复杂调控。(3)利用荧光原位杂交来分析StNACb4表达的组织定位情况,得出其主要在茎和叶的维管束中表达,表明该基因具有维管特异的组织特异性。(4)分别利用VIGS和VOX构建VIGS-NAC-pTRV2沉默载体和VOX-NAC-pTRV2过表达载体并成功转化本氏烟草,经青枯菌处理后发现在相同时间内NACb4基因沉默的植株病害症状最为严重。NACb4基因的沉默能增强烟草对青枯菌的敏感性,相反NACb4基因的过表达则增强了烟草对青枯菌的耐受性。基因功能缺失和过表达实验证实了该基因具有抗病功能。(5)利用台盼蓝染色剂对不同烟草叶片进行染色观察发现,VOX-StNACb4过表达烟草在菌处理后明显触发了细胞死亡,得出StNACb4基因的瞬时过表达能诱导烟草受病原菌胁迫后的超敏反应(HR)细胞死亡。利用苯胺蓝染色剂对用flg22处理的不同烟草叶片染色观察发现,VOX-StNACb4烟草叶片中胼胝质大量沉积,得出StNACb4基因的瞬时过表达能诱导胼胝质沉积的免疫(PTI)反应。表明该基因通过诱导HR和PTI免疫反应来表现出对青枯病的抗性。(6)发现病程相关蛋白PR10的基因StPR10的表达随StNACb4基因上调或衰退而迅速递增或递减,结合启动子分析推断StPR10基因可能是StNACb4的靶基因。综合上述分析,认为StNACb4基因作为正效因子参与马铃薯对青枯病的天然免疫并可能与系统获得性抗性有关,这为后续可能的实践应用提供了理论依据。