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传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的雏鸡的一种急性,高度传染性的免疫抑制性疾病。主要侵害中枢免疫器官—法氏囊,可造成机体免疫抑制,从而降低对疫苗的反应性,增强其他疾病的易感性,对养禽业造成了巨大的危害和经济损失。疫苗接种是预防IBD的主要措施。常规使用的灭活疫苗和弱毒疫苗存在制造工艺和安全性等缺陷,并且中等毒力疫苗可造成法氏囊的损伤。相比传统疫苗,亚单位疫苗具有组分清楚、安全性好、便于工业生产等优点,成为IBDV疫苗研究的重点。VP2是IBDV的主要结构蛋白和主要免疫原性蛋白,含有主要的中和性抗原表位,具有自组装的特性,所以VP2是研究IBDV亚单位疫苗的主要靶蛋白。目前,VP2蛋白已经在大肠杆菌、昆虫细胞、酵母和哺乳动物细胞等不同的表达系统中被表达。为了制备安全、有效且低成本的IBDV亚单位疫苗,我们利用原核表达系统表达IBDV VP2蛋白,采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析等方法对VP2蛋白进行纯化,并对纯化条件进行优化以获得纯度较高的VP2蛋白。随后,以纯化的蛋白为抗原,分别与MontanideTM ISA71VG、MontanideTM ISA71RVG和白油佐剂混合制备亚单位疫苗,并将商品化亚单位、灭活和减毒疫苗作为对照组,肌肉注射SPF鸡,并用IBDV强毒株感染攻击,评价其免疫保护效果,并且比较各种佐剂疫苗的免疫效果以筛选出可有效用于预防IBDV的候选疫苗。主要结果与结论如下:1.用大肠杆菌细胞表达IBDV VP2蛋白,并利用SDS-PAGE及Westem-blot进行鉴定,结果显示VP2蛋白分子质量约为50 kDa,并且具有良好反应原性。原核表达的可溶性VP2蛋白进行琼脂扩散试验,结果显示琼扩效价(AGP)为1:16。纯化结果显示,表达的蛋白经30%饱和硫酸铵粗纯后,再经离子交换层析(Q Sepharose TM Fast Flow,缓冲液pH值为8.0,200 mmol/LNaCl的离子强度洗脱)和疏水层析纯化(Phenyl-SephoroseTM 6 Fast Flow,缓冲液pH为7.4,30 mmol/L Tris-HCl的离子强度洗脱),可获得纯度达85%的VP2蛋白。经动态光散射分析和电镜观察,纯化的VP2蛋白可组装成直径约25 nm的病毒样颗粒。本试验进行了 VP2蛋白的表达和鉴定,并筛选出了方法简便、成本低廉的纯化方法,获得了纯度高且免疫原性好的VP2蛋白,为进一步制备亚单位疫苗奠定了基础。2.通过动物免疫试验,对制备的不同亚单位疫苗的免疫原性进行了评估与比较。检测了免疫后血清中的抗体与细胞因子(IFN-γ,IL-2和IL-4)的含量,结果显示,VLP疫苗组的抗体和IFN-y和IL-2的水平均显著高于PBS组,这说明VLP疫苗可以刺激SPF鸡产生体液免疫和Thl型细胞免疫反应。VLP加佐剂组免疫后的抗体水平和细胞因子含量均高于无佐剂的VLP组,这说明佐剂可增强VLP的免疫效果。不同佐剂疫苗免疫效果相比较,ISA 71 RVG组的抗体和细胞因子含量高于ISA 71 VG和白油佐剂组。攻毒结果显示:VLP加佐剂组的保护率均明显高于VLP组,三种佐剂的免疫保护率分别为:ISA 71 RVG(86.7%)>ISA71 VG(73.3%)>白油佐剂(66.7%)。此外,ISA 71 RVG佐剂组的保护率均高于市场上现有的几种商业化疫苗。本试验结果表明,与其它佐剂相比,ISA71 RVG佐剂与VLP组合可诱导高水平的免疫反应,增强机体抵抗IBDV强毒株的攻击,可以作为预防IBDV的候选疫苗。