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研究目的研究caveolin-1对人乳腺癌BT474细胞的增殖、迁移及侵袭能力的作用及其机制以及对雌激素介导的BT474细胞的自噬和凋亡调控作用及其机制,探讨caveolin-1在人乳腺癌细胞中是否并非仅仅作为抑癌因子,也有作为原癌因子而发挥作用的情况。研究方法第一部分：我们通过荧光定量realtime-PCR技术检测人乳腺癌三种细胞系BT474、MCF7、SK-BR-3中的caveolin-1mRNA的表达水平；使用小分子干扰RNA(siRNA)技术基因敲除高表达caveolin-1的BT474细胞及少量表达caveolin-1的MCF-7细胞中的caveolin-1; Realtime-PCR、western blot、免疫荧光技术检测siRNA敲除caveolin-1的效率；使用CCK-8法、transwell小室、平板克隆形成实验、流失细胞仪检测siRNA分别敲除BT474、MCF-7细胞的caveolin-1后对其细胞的增殖以及对DOX的耐药作用、细胞的迁移及侵袭能力、克隆形成效率及细胞周期的作用；然后使用western blot法检测siRNA敲除BT474细胞的caveolin-1后对其细胞中的ERK1/2分子信号通路、基质金属蛋白酶-1、2、-9(MMP-1、MMP-2、MMP-9)、以及细胞周期相关蛋白c-Fos、cyclin D1、β-catenin,还有对上皮间质转化(EMT)标志物E-cadherin、β-catenin的蛋白水平表达的影响。第二部分：我们通过使用CCK-8、transwell小室法检测雌二醇(E2)对BT474细胞的增殖、迁移及侵袭能力的作用以及siRNA敲除BT474细胞中的caveoin-1之后对此作用的影响；接着使用western blot法检测E2对BT474细胞中的caveolin-1、 HMGB1、自噬相关标志蛋白(LC3Ⅱ、Atg12/5、Beclin-1)蛋白水平表达的作用以及siRNA分别敲除BT474细胞的caveolin-1、HMGB1后对E2的此种作用的影响；采用免疫荧光技术检测BT474细胞胞质内自噬标志蛋白LC3融合蛋白的表达以及E2、caveolin-1siRNA、HMGB1siRNA对LC3融合蛋白形成的作用。我们使用MDC染色法来检测BT474细胞中自噬小体的形成以及E2、caveolin-1及HMGB1的siRNA对此自噬小体的形成的影响。最后我们使用流式细胞仪检测E2以及使用siRNA基因敲除caveolin-1、 HMGB1后对BT474细胞凋亡率的作用；同时采用免疫荧光技术检测上述干预作用对BT474细胞胞质内中cleaved-caspase3凋亡小体形成的作用。实验结果来自三次独立的重复实验,采用SPSS11.0软件进行统计学分析。P<0.05视作具有统计学差异。实验结果第一部分：在三种人乳腺癌细胞株BT474、 MCF7. SK-BR-3中,BT474细胞中的caveolin-1mRNA的表达水平远远高于在MCF7. SK-BR-3细胞中的表达水平。使用siRNA技术在基因水平上对BT474及MCF-7细胞中的caveolin-1的敲除效率均可达60%以上,而caveolin-1的蛋白水平表达抑制率可达50%以上。siRNA敲除BT474细胞中的caveolin-1,其细胞增殖以及对DOX的耐药程度、迁移和侵袭能力、克隆形成效率明显低于对照组水平。与对照组相比,siRNA敲除BT474细胞的caveolin-1降低了其细胞中的S期细胞群的比例,同时增加了G0/G1期细胞群比例。而在MCF-7细胞中,siRNA敲除其caveolin-1表达则可促进其细胞增殖、迁移及侵袭,并降低G0/G1期细胞群、增加S期细胞群的比例,促进克隆形成,但对DOX的耐药性无明显作用。在对BT474细胞内的信号分子通路及与增殖、迁移、侵袭相关的蛋白的表达作用方面,其细胞内的caveolin-1被敲除后,胞内的ERK1/2通路的磷酸化程度受到抑制,金属基质蛋白酶MMP-1、-2、-9的蛋白表达水平以及细胞周期相关蛋白cyclin D1、 c-Fos、 β-catenin的表达水平下降,而上皮间质转化(EMT)相关蛋白标志物E-cadherin蛋白表达则升高。第二部分：CCK-8法、Transwell小室的检测结果表明siRNA敲除BT474细胞的caveolin-1可以降低E2诱导的细胞增殖,同时也可以降低E2促进细胞迁移和侵袭能力的程度。Western blot的检测结果表明,E2可以促进BT474细胞中caveolin-1的蛋白表达水平,同时也促进HMGB1、自噬相关标志蛋白(LC3-Ⅱ Atg12/5、 Beclin-1)的蛋白表达水平。对LC3融合蛋白的免疫荧光检测及对自噬小体形成的MDC染色法检测结果表明,E2组中BT474细胞胞质内的LC3融合蛋白、自噬小体形成的比例与对照组相比明显升高。同时,流式细胞仪的检测结果表明E2还可以抑制BT474细胞的细胞凋亡率,而免疫荧光法检测胞质内cleaved-caspase3的表达水平的结果表明E2可以降低BT474细胞胞质内cleaved-caspase3的表达水平。Western blot、免疫荧光、MDC法流式细胞仪的结果还表明,siRNA敲除BT474细胞中的caveolin-1可以减少E2诱导的HMGB1、LC3-Ⅱ Atg12/5的蛋白表达升高的程度,同时E2诱导的LC3融合蛋白以及自噬体的表达比例也明显下降。此外,流式细胞仪、免疫荧光的结果表明siRNA敲除BT474细胞的caveolin-1还能够促进其细胞的凋亡,以及claeved-caspase3的表达。最后,siRNA敲除BT474细胞的HMGB1也可以降低E2诱导的LC3-Ⅱ的表达,同时降低胞质内LC3融合蛋白、自噬体的形成并能够促进其细胞凋亡,增加胞质cleaved-caspase3的蛋白表达水平。研究结论与在人乳腺癌MCF-7细胞中的抑癌作用不同,caveolin-1在BT474细胞中表现为原癌作用。使用siRNA抑制BT474细胞内caveolin-1的表达后可以有效抑制其细胞增殖、迁移以及侵袭能力。这些抑制作用是与细胞内的分子信号通路及相关蛋白的表达水平的变化密切相关的。Caveolin-1还与E2诱导的促BT474细胞增殖作用密切相关。Caveolin-1通过诱导细胞自噬,抑制细胞凋亡,参与到E2诱导的促细胞增殖的过程中。我们的研究结果表明,caveolin-1在乳腺癌细胞中并非仅仅存在作为抑癌因子的情况,它还可以作为原癌因子发挥作用,并且在E2调控的自噬和凋亡中发挥着重要的调控作用。因此,对于caveolin-1在乳腺癌细胞中的作用及其机制,仍需进一步的研究,才能真正使其在乳腺癌的诊断、治疗中发挥作用。