PP2A调控大斑刚毛座腔菌生长发育的机制及其与TOR途径的关系研究

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TOR是雷帕霉素的作用靶标,在丝状真菌中,TOR通过激活蛋白激酶的活性以及抑制蛋白磷酸酯酶的活性,使一些下游的效应物磷酸化,进而达到对细胞生长所需要的一些营养物质代谢的调控,最终实现对细胞生长的调控作用。PP2A参与调节细胞周期、细胞代谢、信号转导等多种生物学过程,PP2A通过终止参与各种磷酸化的过程来阻止细胞进入有丝分裂时期。对PP2A的调控是TOR信号转导的另一个重要机制。TOR的许多下游效应物,在经过雷帕霉素处理后,会迅速发生去磷酸化作用,这些去磷酸化的过程就依靠PP2A和SIT4来完成。大斑刚毛座腔菌(Setosphaeia turcica,俗称玉米大斑病菌)是引起玉米大斑病的致病菌,严重威胁玉米生产安全。本研究利用前期已经获得的StPP2A-C缺失突变体,对其附着胞膨压、糖原、甘油含量等方面进行了系统分析,并通过qRT-PCR方法对其转录组的部分差异基因进行了验证,对PP2A调控病菌生长发育的机制进行了深入探索;利用雷帕霉素对大斑病菌野生型(WT)与PP2A-C缺失突变体(H5)处理后,通过菌株的菌落形态、菌丝生长以及形态、分生孢子产量、附着胞形成以及穿透、TOR通路关键基因与PP2A基因表达量的测定,细胞自噬的观察以及细胞自噬基因表达量的测定等来明确雷帕霉素对大斑病菌的影响,并明确PP2A与TOR通路的关系以及PP2A与细胞自噬的关系。同时,还对PP2A-C基因进行了原核表达,并将其蛋白纯化,为调取互作蛋白作准备。并且对PP2A-C缺失突变体做了进一步分析,主要结果如下:  1.对不同碳氮源的察氏培养基与PDA培养基上WT与H5的生长情况进行了比较,发现H5在PDA上生长明显比WT慢,而在察氏培养基上H5与WT生长速率几乎相同,甚至比野生型快。  2。对WT以及H5附着胞分析显示,H5的膨压比WT中低,在4.5MPa左右,而WT的膨压则在5.4MPa左右。但是,H5的甘油含量比WT中多,H5的甘油含量为62.5μmol/mL,WT的甘油含量为25.5μmol/mL。通过糖原染色观察发现WT的糖原含量比H5中高。  3。对转录组中WT与H5的差异基因进行了初步分析,共找到了286个差异基因,其中165个上调,121个下调,并且通过qRT-PCR方法对部分差异基因与效应因子进行了验证,发现结果正确。并且发现了两条与糖代谢有关的代谢通路。  4.雷帕霉素处理大斑病菌,能够抑制病菌菌落生长,随着雷帕霉素浓度的升高,对菌株的抑制效果越明显。并且产孢量、孢子萌发、附着胞产生以及附着胞穿透情况都受到明显抑制,PP2A-C的缺失使菌株对雷帕霉素更为敏感,所以受到的抑制作用更强。  5.雷帕霉素处理后,菌丝体会产生细胞自噬现象。正常情况下,WT的自噬现象比H5中稍微明显,但是在雷帕霉素处理后,H5中的细胞自噬现象却比WT中更为明显。  6.构建了StPP2A-C与StTAP42的酵母双杂交载体,并用酵母双杂交验证了StPP2A-C与stTAP42的互作关系,发现它们确实存在互作。  7.构建了StPP2A-C原核表达载体,并且对StPP2A-C进行了原核表达,获得较纯的StPP2A-C蛋白,为后续调取PP2A-C的互作蛋白提供了依据。  8.构建了StPP2A-B的敲除载体并初步获得两株转化子,为后续继续研究PP2A功能提供了基础。同时本研究还构建了StPP2A-B基因的RNAi沉默载体。  综上所述,PP2A可以通过影响病菌菌丝的生长、影响附着胞膨压的降低、附着胞内甘油含量从而影响大斑病菌的生长发育。雷帕霉素处理能够影响病菌的生长发育,尤其是PP2A-C敲除后,病菌对雷帕霉素更为敏感,并且会引发自噬现象。在玉米大斑病菌中TOR信号途径中的StTAP42与StPP2A-C有互作关系,所以PP2A能参与到TOR信号途径中。
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