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小麦抗叶锈基因Lr35最初来源于斯卑尔脱小麦(Triticum speltoides)，通过与T.monococcum的二倍体回交将其转移到小麦品种马奎斯(Marquis)中，位于2B染色体上，该基因与Sr39紧密连锁，其抗性在二叶期开始表达，六叶期后完全表达，是一个应用潜力很大的抗病基因。因此开展Lr35成株抗性基因的表达研究对于了解小麦的抗病机制、克隆抗病基因、合理利用该基因均具有重要的意义。 本研究借助于cDNA-AFLP技术，以Thatcher为感病对照，研究小麦抗叶锈基因Lr35不同叶期，接菌后不同时间内的基因表达差异。获得如下结果： 1．建立了一套适合于小麦cDNA研究的cDNA-AFLP分析的最优化体系及反应程序。通过以小麦cDNA为模板，对AFLP选扩反应体系进行摸索和优化试验。本研究所用AFLP选扩反应体系为：20μL的反应体系中含有5μL模板cDNA，2μL10×PCRbuffer，10mMdNTP0.4μL，0.6UTaqDNA聚合酶，20mM引物。反应程序：第一个循环是将小麦cDNA 94℃预变性2min；接着94℃变性30s，65℃退火30s(每个循环降-0.7℃)，72℃延伸1min，循环12次；然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环23次；最后一个循环完成后，再72℃延伸2min。 2．应用96对AFLP引物对小麦抗叶锈基因Lr35的不同叶期及接种后不同时间的样品进行筛选，获得到6对能扩增出Lr35不同叶期与对照样品之间的差异表达量或差异表达条带的AFLP引物，分别是E-TG/M-CTC，E-TG/M-CAG，E-TG/M-CAC，E-TC/M-CAT，E-TG/M-CTG和E-YC/M-CAA，共得到68条差异表达的条带。 3．研究发现小麦抗叶锈基因Lr35的差异表达方式分两种：一种表达方式是基因表达量的差异，主要是引物组合E-TC/M-CAT在260bp、195bp和190bp处扩增出Lr35样品中基因的表达量随接种时间的延长而增加，而在感病对照Thatcher中没有出现表达量的增加。另一种表达方式是出现特异性条带，引物组合包括E-TG/M-CTC，E-TG/M-CAG，E-TG/M-CAC，E-TG/M-CTG和E-TC/M-CAA。特别是引物组合E-TG/M-CTG可以从小麦抗叶锈基因Lr35的二叶期到六叶期的样品中扩增出一条195bp左右的特异性条带，而在感病对照Thatcher、Lr35苗期样品和未接种的对照Lr35中缺失这条195bp的条带。该条带在Lr35二叶期样品接种后60h开始表达，三叶期样品48h开始表达，四叶期样品接种后48h开始表达，五叶期样品接种36h后开始表达，六叶期样品接种后36h开始表达，初步说明该条带为Lr35受叶锈菌诱导表达的特异性条带。 4．将所得到的68条差异表达的条带回收扩增，回扩出33条差异条带，回扩效率为49％。将回扩得到的33个差异条带样品进行反向Northern blot验证，共得到7个有显著差异的片段。其中引物E-TG/M-CTG中得到的差异条带经反向Northern blot，证明为小麦抗叶锈基因Lr35表达的特定基因片断，该研究成果为进一步进行抗病基因的克隆奠定了基础。