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嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）是淡水鱼暴发性败血症的主要病原，该菌能够引致淡水鱼的败血症和人的腹泻等。嗜水气单胞菌能分泌一系列胞外酶，这些酶对该细菌的生态适应，生存及致病性起着十分关键的作用。脂酶是嗜水气单胞菌胞外酶的一种，有资料表明某些细菌的脂酶是重要毒力因子。本试验以嗜水气单胞菌我国分离鱼源株Ah J-1株为模版，应用染色体步移技术扩增脂酶基因全长，为进一步研究脂酶的功能奠定基础。1．用10kDa的截流滤膜超滤、25％-50％的硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析，获得纯化的嗜水气单胞菌J-1株胞外脂酶，SDS-PAGE显示分子量约为80kDa。该酶最适作用pH值为7.4，最适作用温度为37℃。将纯化的脂酶腹腔注射小鼠后，小鼠无一死亡；纯化的脂酶与HEp-2细胞共培养，不产生细胞病变，表明该酶对动物和细胞无毒性。2．根据已发表的引物序列合成一对引物，以嗜水气单胞菌J-1株基因组为模板扩增脂酶基因，结果得到一个保守的383bp基因片段。进一步应用染色体步移技术扩增其两侧未知序列，分别以DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ、ScaⅠ、StuⅠ、SmaⅠ6个内切酶酶切的基因组构建6个不同的染色体步移文库，再以染色体步移文库做为模板，设计引物向已获得的保守片段两侧进行PCR扩增，将扩增到的两侧序列与保守片段拼接后得到一个3476bp的片段，通过DNAStar软件分析，找到一个2415bp的开放阅读框，经BLAST软件分析，其与嗜水气单胞菌ATCC 7966脂肪酶、嗜水气单胞菌AH-3磷脂酶A1、嗜水气单胞菌H3脂肪酶、嗜水气单胞菌MCC-2脂肪酶、嗜水气单胞菌JMP636磷脂酶C的序列同源性分别为97％、97％、88％、83％和82％。将DNA序列翻译成氨基酸序列后，发现其包含一个多肽序列（VHFLGHSLGA），这个序列在脂酶中是高度保守的。对本实验室保存的35株气单胞菌分离株进行了脂酶的表型检测（三丁酸甘油酯作为底物）和PCR检测，结果分别为83％和100％，特别是嗜水气单胞菌无毒株W1和Ah4332也能检测到脂酶活性或基因，表明脂酶在该菌的致病机制中不是决定性因子。3．以染色体步移获得的序列为模版，用Primer5.0软件设计一对含酶切位点的特异引物扩增脂酶基因全长，经PCR扩增得到目的产物，EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后以正确阅读框架定向克隆于经同样双酶切的pET-32a（+）中，转化表达宿主菌E.coli BL21。该菌株经IPTG诱导可表达分子量约80 kDa的融合蛋白，SDS-PAGE分析表明融合蛋白位于菌体超声裂解后的上清中，用蛋白纯化试剂盒HisTrapTM HP纯化后得到单一的目的蛋白，约80 kDa，且纯化的融合蛋白具有脂酶活性，可以分解三丁酸甘油酯。将纯化融合蛋白腹腔注射接种小鼠和感染HEp-2细胞，结果显示其对小鼠和HEp-2细胞均无毒性。