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米曲霉(Aspergillus oyzae)具有丰富的蛋白酶系,是美国食品与药品监督局公布的安全生产菌株之一,常被作为表达同源和异源蛋白的优秀宿主菌,是亚洲酱油等发酵食品生产的主要菌株。酱油生产中原料蛋白质的利用率和氨基酸出品率直接影响到企业的原料成本和市场竞争力。因此,开发高蛋白酶活力米曲霉菌种具有重要意义。本研究以我国酱油酿造工业中使用的重要菌株A.oryzae3.951作为研究对象,建立了食品级转化系统并进一步构建自克隆中性蛋白酶工程菌。主要研究内容如下：1A.oryzae3.951孢子内细胞核分布的研究对A.oryzae3.951孢子内细胞核DAPI荧光染色条件的优化,当采用5%次氯酸钠处理孢子细胞壁5min,8μg/mL DAPI浓度,染色时间为2h时,孢子内细胞核发出明亮的蓝色荧光。通过观察和分析,A.oryzae3.951孢子内含有1-4个细胞核,其中单核孢子的百分率为16.15%,双核的百分率为74.22%。单核孢子的直径分布在2-5μm之间,大部分集中在3μm。通过5μm的滤膜过滤后其单核孢子的概率为51.24%,3μm滤膜过滤后单核孢子的概率增加至80.41%。通过过滤后虽然不能彻底去除多核的孢子,但是单核孢子的概率明显增加。2A.oryzae pyrG缺陷株的构建以A.oryzae3.951作为出发菌株,用5μm滤膜过滤孢子后进行紫外诱变,筛选得到5-FOA抗性菌株后,采用3μm滤膜过滤5-FOA抗性菌株分离单核孢子,经筛选鉴定得到一株尿嘧啶核苷依赖型菌株命名为A.oryzaeAS11。扩增A.oryzae AS11菌株pyrG并进行测序,发现pyrG的编码序列有6处发生点突变,其中一处点突变导致氨基酸移码突变,造成了pyrG的失活。以含有A.oryzae RIB40pyrG的质粒进行反式互补验证,验证结果显示A.oryzaeAS11可以接受互补质粒恢复野生型表型。该突变株的回复突变率低于10-8个/mL。A.oryzae AS11的产孢子能力及中性蛋白酶的能力与出发菌株A.oryzae3.951相比,产孢能力无显著性差异,中性蛋白酶的活力提高了36.30%。为了进一步验证该转化系统的有效性,以GFP为报告基因,pyrG为选择性标记,成功的进行了GFP的表达。3自克隆中性蛋白酶工程菌的构建采用了两种策略提高菌株中性蛋白酶活性,分别将两个自克隆打靶载体pNP-npI和pNP-gpdA::npl转入A.oryzae AS11中,其中pNP-gpdA::npI里的中性蛋白酶启动子被替换为grpdA启动子。通过pyrG+和niaD双选择标记筛选得到转化子,并通过3μm膜过滤的方法筛选得到同核体转化子命名为A.oryzae PN18和A.oryzae PGN16。A.oryzae PN18较出发菌株A.oryzae3.951中性蛋白酶酶活提高了50.88%,较A.oryzae AS11提高了10.70%。A.oryzaePGN16较A.oryzae AS11未见提高。