新型rhBMP-2缓控载体的设计构建与性能研究

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重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)是公认的最具诱导成骨分化潜力的生长因子,得到国内外研究者的广泛关注。目前临床使用的rhBMP-2主要以物理吸附的方式负载在凝胶海绵载体上,这种较弱的物理吸附力使得rhBMP-2快速释放和流失,进而导致高剂量的使用并引发水肿、炎症、组织病变等一系列副作用。因此研究新型载体实现对rhBMP-2的高活性固载及控释,进而在特定环境中有效发挥其功能,最终达到理想的成骨效果,具有非常重要的意义。为此,本论文以吸附力强且结构多样可调的生物相容性材料介孔二氧化硅纳米粒子为基体,分别从环境响应性控释和药物协同作用的角度设计构建了两种rhBMP-2缓控体系,实现了rhBMP-2的活性固载和控释。同时,以具有一定临床基础的磷酸钙骨水泥(CPC)为基质,通过阿仑膦酸钠/肝素(AH)复合分子的栓系作用,在其表面生物锚定rhBMP-2,构建高活性固载体系。研究取得的成果主要包括以下几个方面:  (1) pH响应型MCF-NOCC蛋白控释体系的构建与性能研究  基于蛋白分子特点,设计制备具有超大孔径的介孔二氧化硅泡沫材料(MCF)。通过在壳聚糖分子的一个氨基位及羟基位上引入羧甲基基团,合成了水溶性的N,O-羧甲基壳聚糖(NOCC)。然后在中性环境中利用硅烷偶联剂将NOCC连接到MCF的表面,构建具有pH响应的MCF-NOCC复合载体。分别以人骨形态发生蛋白(rhBMP-2)及牛血清白蛋白(BSA)为药物模型研究其载药能力及pH响应释放行为,并考察了材料对蛋白活性的影响及材料的生物性能。结果表明,MCF-NOCC复合载体的超大孔道(41.2nm)对rhBMP-2及BSA均具有良好的负载能力;并且该复合载体表现出良好的pH响应性能,在中性环境下(pH=7.4)抑制蛋白释放,酸性环境下(pH=6.0)缓释蛋白分子;同时,NOCC优异的水溶性为材料改性及蛋白负载提供中性环境,有效维持蛋白活性,圆二色谱及ALP检测证明材料对蛋白的二级构象及活性无显著影响;通过将MCF-NOCC与小鼠的骨髓基质细胞(BMSCs)共培养,发现复合载体MCF-NOCC具有良好的生物相容性与促成骨分化能力。  (2)多级枝状介孔二氧化硅纳米粒子的合成及应用  以十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)为模板剂,TEOS为硅源,通过界面法合成了具有枝状介孔的三维纳米球。采用硅烷偶联剂对介孔表面进行氨基改性,并以此为核进一步合成具有多级枝状孔道结构且内层孔径上带有氨基的二氧化硅纳米粒子(DMSN-N)。利用DMSN-N内外不同性质的孔道结构实现药物/蛋白时序释放体系。材料表征结果表明,该纳米粒子呈规则的球形,大小均一,粒径约150-170 nm,具有中心放射状的孔道结构,且降解性能优异。以小分子药物地塞米松(DEX)及大分子蛋白rhBMP-2为药物模型研究该体系的共负载及双释放行为。结果表明,多级介孔结构及氨基表面改性均对DEX具有一定的缓释效果;同时DMSN-N表现出药物/蛋白的时序释放效果,DEX的释放主要集中在早期阶段(前24 h快速释放),而rhBMP-2表现出较为长效的缓释趋势;材料与BMSCs在体外培养的结果表明该纳米粒子DMSN-N具有良好的细胞相容性及ALP活性。  (3)基于阿仑膦酸钠/肝素在磷酸钙骨水泥表面生物锚定rhBMP-2  以磷酸钙骨水泥(CPC)为基体,首先通过酰胺缩合反应合成阿仑膦酸钠/肝素分子(AH),然后利用AH分子一端的阿仑膦酸钠与CPC的相互作用,以及另一端肝素与rhBMP-2的静电吸附作用,将蛋白固载在CPC表面,构建栓系rhBMP-2的CPC-AH复合载体,并考察CPC-AH/rhBMP-2的体内外释放行为及成骨活性。结果表明,CPC-AH/rhBMP-2不仅具有更长的缓释周期和更高的局部浓度,同时呈现优异的促成骨分化能力。体外异位成骨实验证明该体系具有优异的异位骨诱导能力。
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