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摘 要：类黄酮是烟草中普遍存在的多酚化合物，是烟草重要的致香前体物质，其合成代谢是烟草香气物质形成的重要途径。对近年来烟草类黄酮合成相关基因的研究进展进行了综述，并展望了其在烟草中调控重要基因表达和提高烟叶品质中的应用潜力。
关键词：烟草；类黄酮；结构基因；调控基因；应用
中图分类号：S572.03 文章编号：1007-5119（2016）02-0095-04 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.02.017
Abstract： Flavonoids are a common group of polyphenolic compounds and the most important precursors for aroma components in tobacco （Nicotiana tabacum）. In this paper， the current research progress on the related genes of tobacco involved in flavonoid biosynthesis pathways was summarized. It provided useful information for application of the molecular regulation of flavonoid biosynthetic genes for improvement of tobacco leaf quality.
Keywords： tobacco； flavonoid； structural gene； regulator gene； application
类黄酮（flavonoid）是一类广泛存在于植物中的次生代谢物质。类黄酮参与植物的生长发育、花和果实的着色反应以及抗逆反应。迄今为止，对植物体内类黄酮合成代谢途径的研究已较为深入，途径中的一系列关键酶基因（结构基因）和转录因子（即调控基因）已在多个物种中被相继报道。类黄酮不仅对烟草的生长发育起重要作用，而且是烟叶品质的关键影响因素。类黄酮中的绿原酸、芸香苷等与烟叶的香气、色泽及品质密切相关，赋予烟气清甜香和烤香[1]；此外，烟叶等级的高低很大程度上取决于烟草中芸香苷和绿原酸的含量高低，一般情况，烟叶级别较高时，芸香苷和绿原酸在烟叶中所占的比例也较高[2]。因此，烟草类黄酮物质合成代谢调控对研究烟草生长发育和烟叶香气品质具有重要意义。
1 植物类黄酮合成关键酶基因和调控基因
1.1 植物类黄酮合成关键酶基因
类黄酮化合物主要通过苯丙烷代谢途径和类黄酮代谢途径来合成。类黄酮化合物的合成起始于L-苯丙氨酸，其在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的作用下形成反式肉桂酸，随后在肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和4-香豆酸CoA的连接酶 （4CL）等关键酶的作用下形成4-香豆酸-CoA。4-香豆酸-CoA提供了苯丙烷代谢途径与类黄酮代谢途径之间的代谢联系。4-香豆酸-CoA通过查尔酮合成酶（CHS）进入类黄酮合成代谢途径[3]。CHS是类黄酮代谢途径的第一个关键酶，它催化一分子的4-香豆酸-CoA与三分子的丙二酰-CoA形成柚配基查尔酮。随后，柚配基查尔酮在CHI、DFR、FLS、F3H、ANS、UGT等一系列酶的作用下进入不同的分支合成代谢途径，衍生转化形成黄酮、黄酮醇、黄烷醇、类黄酮醇、花青苷等各类黄酮化合物[4]。
植物中已经发现多个类黄酮合成途径中关键酶基因的突变体，如拟南芥中已经分离到多个关键酶基因的突变体，包括tt3、tt4、tt5、tt6、tt7、tt10、tt15、tt18/tt11/tdsA、fls1、ban，对应的结构基因分别是DFR、CHS、CHI、F3H、F3’H、PPO、GT、LDOX、FLS和ANR[5]。研究发现，CHS、CHI、DFR、F3H、ANS和ANR与植物花色相关，调控上述基因的表达水平，能够显著地影响植物花青素和原花色素的含量变化[6-10]。FLS与DFR存在竞争共同底物的关系，利用二氢黄酮醇分别催化合成黄酮醇和花青素。拟南芥fls1突变体中花青素的含量增加，而几乎检测不到黄酮醇的含量[11]。对共同底物的竞争结果将决定花的颜色以及黄酮醇含量的变化[12]。
1.2 植物类黄酮合成调控基因
类黄酮化合物合成的调控主要包括转录水平调控和转录后调控。研究发现，MYB类转录因子、bHLH类转录因子、WD40类转录因子和WRKY类转录因子等主要参与类黄酮合成代谢的调控[13-14]。MYB类转录因子、bHLH类转录因子和WD40类转录因子往往形成MYB-bHLH-WD40复合体（简称MBW复合体）起调控作用[15]。上述转录因子形成一个复杂的调控网络，控制着类黄酮合成代谢的时空特异表达及其表达水平，对于这些转录因子的研究能够为控制类黄酮合成代谢提供重要的理论依据。
目前，拟南芥中参与类黄酮合成途径的调控网络已经研究得比较清楚[13]。MYB类转录因子包括PFG1/PFG2/PFG3、PAP1/PAP2、TT2、AtMYB12、AtMYB113和AtMYB114等正调控转录因子，以及参与负调控的MYB4亚家族的AtMYB3/4/7/32和R2-MYB、R3-MYB等转录抑制因子[16-18]。bHLH类转录因子包括GL3/ EGL3、tt8[19]，WD40类转录因子ttg1[20]以及WRKY类转录因子ttg2[21]等。这些转录因子可以通过互作共同调控类黄酮途径，也可直接调控[13，22]。
2 烟草类黄酮合成关键酶基因和调控基因
2.1 烟草类黄酮合成关键酶基因
目前已从烟草中分离或克隆获得多个参与类黄酮合成代谢途径的关键酶基因，这些基因在烟草基因组中大多以多拷贝形式存在，且在不同组织和器官中呈现时空特异表达的特性[23-25]。贾宏等[26]对广东、安徽和河南3个不同生态区的烤烟品种的类黄酮合成关键酶基因的表达情况进行分析发现，不同生态区不同品种间关键酶基因PAL、CHS和CHI的表达强度和表达趋势差异较大，C4L和4CL的表达强度和表达趋势差异较小，说明PAL、CHS和CHI，尤其是CHI基因在3个生态区浓香型烤烟类黄酮物质形成中起关键作用。基因功能研究发现，莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶（HCT）参与烟草绿原酸的合成，过量表达NtHCT基因能够使转基因烟草中绿原酸、芦丁、山奈酚芸香苷等类黄酮物质含量得到很大程度的提高[27]。通过过表达或RNAi干扰技术调节烟草查尔酮酶基因（CHS）的表达量，也能够影响转基因烟草中绿原酸、芸香苷等类黄酮化合物以及多酚物质含量的变化[28]。Atanassov等[29]在野生烟草花药中克隆到一个组织特异表达的查尔酮合成酶基因（NSCHSLK），分析发现其与花粉单核孢子的发育相关。研究表明CHS基因与雄性不育有关，CHS基因的异常表达使得花粉无法正常合成黄酮类物质，导致植株无法供应花粉正常发育所需的营养，从而导致花粉不育[30-32]。抑制烟草中CHI基因的表达，能够降低烟草花色素含量，改变花瓣中类黄酮物质含量[33]。过量表达DFR或F3’5’H基因，都能够引起烟草花色加深[34-35]。Mahajan等[36]研究发现，抑制或沉默FLS基因表达的转基因烟草的花期延后，并且烟草果实的籽粒数减少或产生无籽果实。转基因烟草中黄酮醇、花青素含量降低，而黄烷醇类物质如儿茶酚、焦儿茶酸等含量升高。进一步研 究发现，含量升高的黄烷醇类物质能够增强谷胱甘肽还原酶（GR）、抗坏血酸过氧化物酶（APx）、过氧化物酶（CAT）等抗氧化酶转录水平的表达量，而降低谷胱甘肽-S-转移酶（GST）转录水平的表达量[37]，增强植株对活性氧的清除能力。过量表达NtUGT1基因降低转基因烟草叶片中类黄酮化合物如二氢山奈酚、山奈酚-3-芸香苷、二氢槲皮素、芦丁等物质含量[38]。
2.2 烟草类黄酮合成调控基因
烟草中含有种类繁多、含量丰富的类黄酮物质，调控其合成代谢的调控网络也非常复杂，涉及到众多的调控因子。目前在烟草中分离到的参与类黄酮合成代谢的转录因子较少，主要是MYB-R2R3类转录因子和bHLH类转录因子。MYB-R2R3类转录因子NtAn2 是最早在烟草花器官中克隆到的参与类黄酮代谢途径的转录因子。在拟南芥和烟草中异位表达NtAn2能够引起整株植株的花青素积累，而抑制其表达则导致植株花色变白[25]。进一步的研究发现，低温条件下NtAn2的上调表达是花青素积累所必需的，并激活花青素合成酶基因NtANS的表达[39]。Bai等[40]从烟草花器官中分离到两个bHLH转录因子，NtAn1a和NtAn1b。研究发现，NtAn1a和NtAn1b与NtAn2之间存在强烈的蛋白互作。进一步分析发现NtAn1a、NtAn1b 与 NtAn2三者单独存在均不能激活类黄酮合成途径的两个关键基因 DFR 或 CHS 的启动子，但将NtAn1a、NtAn1b分别与NtAn2组合后 （NtAn1a + NtAn2 或 NtAn1b + NtAn2） 均能激活两个启动子，说明 NtAn1 和 NtAn2 蛋白共同参与烟草花中花青素途径的调节。
3 前景与展望
类黄酮合成代谢途径非常庞大，已经发现有至少8条分支代谢途径，目前对花青素合成分支途径的研究较为深入，而其他分支途径的研究还尚待深入。在烟草中，类黄酮代谢是烟草香气物质形成的重要途径。对烟草类黄酮合成代谢途径关键酶基因和调控基因的研究对于提高烟草品质有着重要的意义。此外，通过转基因手段或基因编辑技术，调控烟草花和叶片中花青素合成相关基因或转录因子的表达量，形成各类颜色的观赏烟草，能够提高烟草的观赏价值；调控烟草叶片中类黄酮化合物合成的关键基因或转录因子的表达量，获得能够高产芸香苷、绿原酸、儿茶酚、槲皮素等强药理活性物质的烟草植株或烟草悬浮细胞系，提高烟草在医药、食品等领域的利用价值，对拓展烟草综合利用市场以及对烟草行业的可持续发展都具有非常重要的意义。
参考文献
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关键词：烟草；类黄酮；结构基因；调控基因；应用
中图分类号：S572.03 文章编号：1007-5119（2016）02-0095-04 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.02.017
Abstract： Flavonoids are a common group of polyphenolic compounds and the most important precursors for aroma components in tobacco （Nicotiana tabacum）. In this paper， the current research progress on the related genes of tobacco involved in flavonoid biosynthesis pathways was summarized. It provided useful information for application of the molecular regulation of flavonoid biosynthetic genes for improvement of tobacco leaf quality.
Keywords： tobacco； flavonoid； structural gene； regulator gene； application
类黄酮（flavonoid）是一类广泛存在于植物中的次生代谢物质。类黄酮参与植物的生长发育、花和果实的着色反应以及抗逆反应。迄今为止，对植物体内类黄酮合成代谢途径的研究已较为深入，途径中的一系列关键酶基因（结构基因）和转录因子（即调控基因）已在多个物种中被相继报道。类黄酮不仅对烟草的生长发育起重要作用，而且是烟叶品质的关键影响因素。类黄酮中的绿原酸、芸香苷等与烟叶的香气、色泽及品质密切相关，赋予烟气清甜香和烤香[1]；此外，烟叶等级的高低很大程度上取决于烟草中芸香苷和绿原酸的含量高低，一般情况，烟叶级别较高时，芸香苷和绿原酸在烟叶中所占的比例也较高[2]。因此，烟草类黄酮物质合成代谢调控对研究烟草生长发育和烟叶香气品质具有重要意义。
1 植物类黄酮合成关键酶基因和调控基因
1.1 植物类黄酮合成关键酶基因
类黄酮化合物主要通过苯丙烷代谢途径和类黄酮代谢途径来合成。类黄酮化合物的合成起始于L-苯丙氨酸，其在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的作用下形成反式肉桂酸，随后在肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和4-香豆酸CoA的连接酶 （4CL）等关键酶的作用下形成4-香豆酸-CoA。4-香豆酸-CoA提供了苯丙烷代谢途径与类黄酮代谢途径之间的代谢联系。4-香豆酸-CoA通过查尔酮合成酶（CHS）进入类黄酮合成代谢途径[3]。CHS是类黄酮代谢途径的第一个关键酶，它催化一分子的4-香豆酸-CoA与三分子的丙二酰-CoA形成柚配基查尔酮。随后，柚配基查尔酮在CHI、DFR、FLS、F3H、ANS、UGT等一系列酶的作用下进入不同的分支合成代谢途径，衍生转化形成黄酮、黄酮醇、黄烷醇、类黄酮醇、花青苷等各类黄酮化合物[4]。
植物中已经发现多个类黄酮合成途径中关键酶基因的突变体，如拟南芥中已经分离到多个关键酶基因的突变体，包括tt3、tt4、tt5、tt6、tt7、tt10、tt15、tt18/tt11/tdsA、fls1、ban，对应的结构基因分别是DFR、CHS、CHI、F3H、F3’H、PPO、GT、LDOX、FLS和ANR[5]。研究发现，CHS、CHI、DFR、F3H、ANS和ANR与植物花色相关，调控上述基因的表达水平，能够显著地影响植物花青素和原花色素的含量变化[6-10]。FLS与DFR存在竞争共同底物的关系，利用二氢黄酮醇分别催化合成黄酮醇和花青素。拟南芥fls1突变体中花青素的含量增加，而几乎检测不到黄酮醇的含量[11]。对共同底物的竞争结果将决定花的颜色以及黄酮醇含量的变化[12]。
1.2 植物类黄酮合成调控基因
类黄酮化合物合成的调控主要包括转录水平调控和转录后调控。研究发现，MYB类转录因子、bHLH类转录因子、WD40类转录因子和WRKY类转录因子等主要参与类黄酮合成代谢的调控[13-14]。MYB类转录因子、bHLH类转录因子和WD40类转录因子往往形成MYB-bHLH-WD40复合体（简称MBW复合体）起调控作用[15]。上述转录因子形成一个复杂的调控网络，控制着类黄酮合成代谢的时空特异表达及其表达水平，对于这些转录因子的研究能够为控制类黄酮合成代谢提供重要的理论依据。
目前，拟南芥中参与类黄酮合成途径的调控网络已经研究得比较清楚[13]。MYB类转录因子包括PFG1/PFG2/PFG3、PAP1/PAP2、TT2、AtMYB12、AtMYB113和AtMYB114等正调控转录因子，以及参与负调控的MYB4亚家族的AtMYB3/4/7/32和R2-MYB、R3-MYB等转录抑制因子[16-18]。bHLH类转录因子包括GL3/ EGL3、tt8[19]，WD40类转录因子ttg1[20]以及WRKY类转录因子ttg2[21]等。这些转录因子可以通过互作共同调控类黄酮途径，也可直接调控[13，22]。
2 烟草类黄酮合成关键酶基因和调控基因
2.1 烟草类黄酮合成关键酶基因
目前已从烟草中分离或克隆获得多个参与类黄酮合成代谢途径的关键酶基因，这些基因在烟草基因组中大多以多拷贝形式存在，且在不同组织和器官中呈现时空特异表达的特性[23-25]。贾宏等[26]对广东、安徽和河南3个不同生态区的烤烟品种的类黄酮合成关键酶基因的表达情况进行分析发现，不同生态区不同品种间关键酶基因PAL、CHS和CHI的表达强度和表达趋势差异较大，C4L和4CL的表达强度和表达趋势差异较小，说明PAL、CHS和CHI，尤其是CHI基因在3个生态区浓香型烤烟类黄酮物质形成中起关键作用。基因功能研究发现，莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶（HCT）参与烟草绿原酸的合成，过量表达NtHCT基因能够使转基因烟草中绿原酸、芦丁、山奈酚芸香苷等类黄酮物质含量得到很大程度的提高[27]。通过过表达或RNAi干扰技术调节烟草查尔酮酶基因（CHS）的表达量，也能够影响转基因烟草中绿原酸、芸香苷等类黄酮化合物以及多酚物质含量的变化[28]。Atanassov等[29]在野生烟草花药中克隆到一个组织特异表达的查尔酮合成酶基因（NSCHSLK），分析发现其与花粉单核孢子的发育相关。研究表明CHS基因与雄性不育有关，CHS基因的异常表达使得花粉无法正常合成黄酮类物质，导致植株无法供应花粉正常发育所需的营养，从而导致花粉不育[30-32]。抑制烟草中CHI基因的表达，能够降低烟草花色素含量，改变花瓣中类黄酮物质含量[33]。过量表达DFR或F3’5’H基因，都能够引起烟草花色加深[34-35]。Mahajan等[36]研究发现，抑制或沉默FLS基因表达的转基因烟草的花期延后，并且烟草果实的籽粒数减少或产生无籽果实。转基因烟草中黄酮醇、花青素含量降低，而黄烷醇类物质如儿茶酚、焦儿茶酸等含量升高。进一步研 究发现，含量升高的黄烷醇类物质能够增强谷胱甘肽还原酶（GR）、抗坏血酸过氧化物酶（APx）、过氧化物酶（CAT）等抗氧化酶转录水平的表达量，而降低谷胱甘肽-S-转移酶（GST）转录水平的表达量[37]，增强植株对活性氧的清除能力。过量表达NtUGT1基因降低转基因烟草叶片中类黄酮化合物如二氢山奈酚、山奈酚-3-芸香苷、二氢槲皮素、芦丁等物质含量[38]。
2.2 烟草类黄酮合成调控基因
烟草中含有种类繁多、含量丰富的类黄酮物质，调控其合成代谢的调控网络也非常复杂，涉及到众多的调控因子。目前在烟草中分离到的参与类黄酮合成代谢的转录因子较少，主要是MYB-R2R3类转录因子和bHLH类转录因子。MYB-R2R3类转录因子NtAn2 是最早在烟草花器官中克隆到的参与类黄酮代谢途径的转录因子。在拟南芥和烟草中异位表达NtAn2能够引起整株植株的花青素积累，而抑制其表达则导致植株花色变白[25]。进一步的研究发现，低温条件下NtAn2的上调表达是花青素积累所必需的，并激活花青素合成酶基因NtANS的表达[39]。Bai等[40]从烟草花器官中分离到两个bHLH转录因子，NtAn1a和NtAn1b。研究发现，NtAn1a和NtAn1b与NtAn2之间存在强烈的蛋白互作。进一步分析发现NtAn1a、NtAn1b 与 NtAn2三者单独存在均不能激活类黄酮合成途径的两个关键基因 DFR 或 CHS 的启动子，但将NtAn1a、NtAn1b分别与NtAn2组合后 （NtAn1a + NtAn2 或 NtAn1b + NtAn2） 均能激活两个启动子，说明 NtAn1 和 NtAn2 蛋白共同参与烟草花中花青素途径的调节。
3 前景与展望
类黄酮合成代谢途径非常庞大，已经发现有至少8条分支代谢途径，目前对花青素合成分支途径的研究较为深入，而其他分支途径的研究还尚待深入。在烟草中，类黄酮代谢是烟草香气物质形成的重要途径。对烟草类黄酮合成代谢途径关键酶基因和调控基因的研究对于提高烟草品质有着重要的意义。此外，通过转基因手段或基因编辑技术，调控烟草花和叶片中花青素合成相关基因或转录因子的表达量，形成各类颜色的观赏烟草，能够提高烟草的观赏价值；调控烟草叶片中类黄酮化合物合成的关键基因或转录因子的表达量，获得能够高产芸香苷、绿原酸、儿茶酚、槲皮素等强药理活性物质的烟草植株或烟草悬浮细胞系，提高烟草在医药、食品等领域的利用价值，对拓展烟草综合利用市场以及对烟草行业的可持续发展都具有非常重要的意义。
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