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摘要：目的：观察重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）对四氯化碳（CCL4）肝硬化大鼠外周血中CD34+细胞的动员作用，以及对肝硬化大鼠肝脏生化学的影响，寻求一种安全有效、不加重肝损伤的动员CD34+细胞的方法。方法：50%CCL4橄榄油溶液建立肝硬化大鼠模型，rhG-CSF动员组大鼠皮下注射rhG-CSF10gkg-1d-1，共计5d，对照组给予相同剂量生理盐水。流式细胞仪测定外周血单个核细胞中的CD34+细胞的比例，同时检测ALT、AST、T-BIL和ALB，观察G-CSF对肝硬化大鼠肝脏的影响。结果：肝硬化大鼠rhG-CSF动员后外周血CD34+细胞占单个核细胞（CD34+/MNC）比例（4.081.38）%是生理盐水对照组（0.430.21）%的9.5倍；而生化学检测两组没有显著性差异。结论：G-CSF动员能促进更多的骨髓/造血干细胞源性的肝干细胞在外周血中表达，而且不加重肝硬化大鼠的肝脏损伤。
关键词：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）；干细胞；CD34细胞动员
肝炎病毒、酒精、药物、化学物质以及遗传代谢等等诸多原因皆可以损伤肝脏功能，最终表现为肝硬化、肝功能衰竭等终末期肝脏病变，严重危害人们的身体健康。终末期肝病一般需要肝移植才能彻底解决，但是由于肝脏供体来源受限，人们逐渐尝试肝干细胞替代治疗的方法来让病人度过手术等待期，或用这种方法进行肝脏病人的治疗。
目前认为肝脏干细胞主要有肝源性和非肝源性两个方面的来源。肝源性肝干细胞主要为肝卵圆细胞（hepaticovalcell，HOC）。HOC是从小鼠肝脏中分离出来的，当各种致病因素使肝细胞增殖受限时，HOC可进一步分化为肝细胞及胆管上皮细胞，因而认为是一种肝干细胞。现在已经有证据表明至少有一部分HOC是由骨髓源前体细胞演变而来。Crosby采用骨髓造血干细胞标志c-Kit和CD34观察肝硬化患者肝组织存在着CD34+细胞，其主要位于胆管周围的门静脉区。因此，HOC是一类具有骨髓干细胞的某些表型、克隆原性及双向分化潜能的细胞。
骨髓/造血干细胞可以由骨髓、脐带血和外周血三种来源获得。外周血造血干细胞有着收集方便、来源广泛、供体不需要麻醉、创伤小以及易于患者接受等优势，因而受到了越来越多的重视。
本研究是通过粒细胞集落刺激因子（granularcellstimu latingfactor，G-CSF）对四氯化碳（CCL4）致肝硬化大鼠进行动员，检测肝脏以及外周血中CD34+细胞表达的变化，观察G-CSF对外周血干细胞的动员作用，同时观察动员的肝硬化大鼠肝脏的生化学、组织病理学改变，评价G-CSF对肝硬化大鼠机体的影响。
1材料和方法
1.1实验动物
雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠36只，体重180～220g，由大连医科大学实验动物中心提供。实验前分笼饲养，自由饮水，室温22～26，饲养1周后用于实验。
1.2主要试剂及药品
重组人粒细胞集落刺激因子、兔抗鼠CD34抗体、FITC-羊抗兔IgG抗体、RPMI1640、胎牛血清和Ficoll分离液分别由日本麒麟株式会社、Santa-Cruz公司、Jackson公司、Gibco公司和Sigma公司生产。
1.3实验分组
将36只大鼠随机分为四组，正常组6只，不进行任何处理。余30只进行CCL4造模，造模成功后处死6只作为肝硬化模型组。对造模成功的大鼠随机分为生理盐水组和G-CSF动员组各8只。
1.4实验方法
1.4.1肝硬化模型的制备
经大鼠大腿内侧、背部、腹部皮下注射50%的橄榄油CCL4溶液（橄榄油与CCL4的体积比为1?1），剂量3mL/kg，1次/3d，测量大鼠体重，根据体重调整剂量，注射23次后停药观察大鼠体重，以不增加为准，若仍体重增加，原量注射直至体重恒定。肝脏组织病理学证实模型成功。
1.4.2肝脏组织病理学检查。对肝硬化模型建立的组织病理，使用石蜡切片。取造模大鼠肝脏右叶，切成1cm#1cm#0.5cm大小组织块，10%甲醛固定，石蜡包埋，5m切片，行HE染色和Masson染色。常规病理制片，显微镜下由同一名病理医生阅片，找寻10步骤的拍摄区域普通显微镜拍照。
1.4.3G-CSF动员
动员组8只大鼠每天早晨9点钟，皮下注射G-CSF10gkg- 1d-1，连续5d，对照组8只注射同剂量生理盐水。
1.4.4肝功能生化学检查
血清采集后-20！保存，一次上机检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（T-BIL）和白蛋白（ALB），由同一全自动生化分析仪完成。
1.4.5动员后外周血CD34+细胞表达的评价
MNC的提取%流式细胞仪检测MNC中CD34+细胞
1.4.6统计学分析。使用SPSS10.0软件对正常大鼠、肝硬化大鼠、G-CSF动员后大鼠的ALT、AST、TBIL、ALB以及流式细胞仪检测的CD34+细胞占MNC的百分比进行统计分析，计量资料采用xs（均数标准差）表示，方差齐时t检验，方差不齐t&检验。等级资料采用卡方检验。
2结果
2.1肝硬化动物模型的建立
30只大鼠使用50%CCL4造模过程中，死亡4只，死亡率13.3%。经HE、Masson染色进行肝脏组织病理学检查，可见胶原纤维大量增生、包绕变性坏死肝细胞及大小不等的假小叶形成等，组织学证实肝硬化造模成功。50%CCL4皮下注射26次后，大鼠ALT，AST，TBIL都有不同程度的升高（P<0.01），白蛋白下降（P<0.01）。提示造模大鼠有明显的肝功能损害。
2.2G-CSF动员效果对比
使用流式细胞仪对周血中CD34+细胞进行检测。结果显示，动员组肝硬化大鼠外周血中CD34+细胞占MNC比例为（4.081.38）%，是生理盐水组（0.43+-0.21）%的9.5倍，P<0.01。
2.3使用rhG-CSF动员与生理盐水对照组生化指标对比
两组肝功能生化指标（ALT、AST、ALB、TBIL）变化对比，无显著性差异，P>0.05。
3讨论
G-CSF是由Welte等在1985年克隆并纯化的，由2个长环和1个短环连接的4条反向平行的螺旋链组成。自90年代初获准临床应用。目前认为G-CSF动员的机制主要有以下幾个方面：?影响造血干细胞表面黏附分子的表达及功能，特异性诱导粒系祖细胞的增殖、分化和成熟，并抑制外周血造血干细胞的凋亡。下调骨髓微环境内皮细胞粘附分子的表达，促进基质金属蛋白酶释放及降解细胞外基质。G-CSF对CD34+细胞的动员作用是呈动态变化的。研究发现，对健康者皮下注射G-CSF，外周血CD34+细胞数量在第6天达到高峰，其数量与G-CSF用量相关。本研究通过流式细胞仪检测发现，肝硬化大鼠G-CSF连续使用5d后，外周血中CD34+细胞占单个核细胞的比例较使用生理盐水增加了9.5倍。G-CSF对肝硬化大鼠外周血中的CD34+细胞有很明显的动员作用，且没有加重肝脏损伤的影响。目前，对肝硬化个体的动员以获得CD34+细胞的研究还未见报道。
综上所述，G-CSF对肝硬化大鼠是一种安全有效的获取外周血中更多CD34+细胞的方法。动员后的外周血中骨髓/造血干细胞源性的肝干细胞，可以用于多种部位的自体移植或者在体外培养扩增分化为肝细胞的研究，从而为各种终末期肝病的细胞学治疗提供一种可能的细胞来源。
参考文献：
[1]立野知世，吉田胜利.肝胆细胞.蛋白核酸酵素.[J] 2000，45：2085-2091
关键词：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）；干细胞；CD34细胞动员
肝炎病毒、酒精、药物、化学物质以及遗传代谢等等诸多原因皆可以损伤肝脏功能，最终表现为肝硬化、肝功能衰竭等终末期肝脏病变，严重危害人们的身体健康。终末期肝病一般需要肝移植才能彻底解决，但是由于肝脏供体来源受限，人们逐渐尝试肝干细胞替代治疗的方法来让病人度过手术等待期，或用这种方法进行肝脏病人的治疗。
目前认为肝脏干细胞主要有肝源性和非肝源性两个方面的来源。肝源性肝干细胞主要为肝卵圆细胞（hepaticovalcell，HOC）。HOC是从小鼠肝脏中分离出来的，当各种致病因素使肝细胞增殖受限时，HOC可进一步分化为肝细胞及胆管上皮细胞，因而认为是一种肝干细胞。现在已经有证据表明至少有一部分HOC是由骨髓源前体细胞演变而来。Crosby采用骨髓造血干细胞标志c-Kit和CD34观察肝硬化患者肝组织存在着CD34+细胞，其主要位于胆管周围的门静脉区。因此，HOC是一类具有骨髓干细胞的某些表型、克隆原性及双向分化潜能的细胞。
骨髓/造血干细胞可以由骨髓、脐带血和外周血三种来源获得。外周血造血干细胞有着收集方便、来源广泛、供体不需要麻醉、创伤小以及易于患者接受等优势，因而受到了越来越多的重视。
本研究是通过粒细胞集落刺激因子（granularcellstimu latingfactor，G-CSF）对四氯化碳（CCL4）致肝硬化大鼠进行动员，检测肝脏以及外周血中CD34+细胞表达的变化，观察G-CSF对外周血干细胞的动员作用，同时观察动员的肝硬化大鼠肝脏的生化学、组织病理学改变，评价G-CSF对肝硬化大鼠机体的影响。
1材料和方法
1.1实验动物
雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠36只，体重180～220g，由大连医科大学实验动物中心提供。实验前分笼饲养，自由饮水，室温22～26，饲养1周后用于实验。
1.2主要试剂及药品
重组人粒细胞集落刺激因子、兔抗鼠CD34抗体、FITC-羊抗兔IgG抗体、RPMI1640、胎牛血清和Ficoll分离液分别由日本麒麟株式会社、Santa-Cruz公司、Jackson公司、Gibco公司和Sigma公司生产。
1.3实验分组
将36只大鼠随机分为四组，正常组6只，不进行任何处理。余30只进行CCL4造模，造模成功后处死6只作为肝硬化模型组。对造模成功的大鼠随机分为生理盐水组和G-CSF动员组各8只。
1.4实验方法
1.4.1肝硬化模型的制备
经大鼠大腿内侧、背部、腹部皮下注射50%的橄榄油CCL4溶液（橄榄油与CCL4的体积比为1?1），剂量3mL/kg，1次/3d，测量大鼠体重，根据体重调整剂量，注射23次后停药观察大鼠体重，以不增加为准，若仍体重增加，原量注射直至体重恒定。肝脏组织病理学证实模型成功。
1.4.2肝脏组织病理学检查。对肝硬化模型建立的组织病理，使用石蜡切片。取造模大鼠肝脏右叶，切成1cm#1cm#0.5cm大小组织块，10%甲醛固定，石蜡包埋，5m切片，行HE染色和Masson染色。常规病理制片，显微镜下由同一名病理医生阅片，找寻10步骤的拍摄区域普通显微镜拍照。
1.4.3G-CSF动员
动员组8只大鼠每天早晨9点钟，皮下注射G-CSF10gkg- 1d-1，连续5d，对照组8只注射同剂量生理盐水。
1.4.4肝功能生化学检查
血清采集后-20！保存，一次上机检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（T-BIL）和白蛋白（ALB），由同一全自动生化分析仪完成。
1.4.5动员后外周血CD34+细胞表达的评价
MNC的提取%流式细胞仪检测MNC中CD34+细胞
1.4.6统计学分析。使用SPSS10.0软件对正常大鼠、肝硬化大鼠、G-CSF动员后大鼠的ALT、AST、TBIL、ALB以及流式细胞仪检测的CD34+细胞占MNC的百分比进行统计分析，计量资料采用xs（均数标准差）表示，方差齐时t检验，方差不齐t&检验。等级资料采用卡方检验。
2结果
2.1肝硬化动物模型的建立
30只大鼠使用50%CCL4造模过程中，死亡4只，死亡率13.3%。经HE、Masson染色进行肝脏组织病理学检查，可见胶原纤维大量增生、包绕变性坏死肝细胞及大小不等的假小叶形成等，组织学证实肝硬化造模成功。50%CCL4皮下注射26次后，大鼠ALT，AST，TBIL都有不同程度的升高（P<0.01），白蛋白下降（P<0.01）。提示造模大鼠有明显的肝功能损害。
2.2G-CSF动员效果对比
使用流式细胞仪对周血中CD34+细胞进行检测。结果显示，动员组肝硬化大鼠外周血中CD34+细胞占MNC比例为（4.081.38）%，是生理盐水组（0.43+-0.21）%的9.5倍，P<0.01。
2.3使用rhG-CSF动员与生理盐水对照组生化指标对比
两组肝功能生化指标（ALT、AST、ALB、TBIL）变化对比，无显著性差异，P>0.05。
3讨论
G-CSF是由Welte等在1985年克隆并纯化的，由2个长环和1个短环连接的4条反向平行的螺旋链组成。自90年代初获准临床应用。目前认为G-CSF动员的机制主要有以下幾个方面：?影响造血干细胞表面黏附分子的表达及功能，特异性诱导粒系祖细胞的增殖、分化和成熟，并抑制外周血造血干细胞的凋亡。下调骨髓微环境内皮细胞粘附分子的表达，促进基质金属蛋白酶释放及降解细胞外基质。G-CSF对CD34+细胞的动员作用是呈动态变化的。研究发现，对健康者皮下注射G-CSF，外周血CD34+细胞数量在第6天达到高峰，其数量与G-CSF用量相关。本研究通过流式细胞仪检测发现，肝硬化大鼠G-CSF连续使用5d后，外周血中CD34+细胞占单个核细胞的比例较使用生理盐水增加了9.5倍。G-CSF对肝硬化大鼠外周血中的CD34+细胞有很明显的动员作用，且没有加重肝脏损伤的影响。目前，对肝硬化个体的动员以获得CD34+细胞的研究还未见报道。
综上所述，G-CSF对肝硬化大鼠是一种安全有效的获取外周血中更多CD34+细胞的方法。动员后的外周血中骨髓/造血干细胞源性的肝干细胞，可以用于多种部位的自体移植或者在体外培养扩增分化为肝细胞的研究，从而为各种终末期肝病的细胞学治疗提供一种可能的细胞来源。
参考文献：
[1]立野知世，吉田胜利.肝胆细胞.蛋白核酸酵素.[J] 2000，45：2085-2091