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[摘要] 目的 应用iTRAQ技术分析绝经前后三阴性乳腺癌组织差异蛋白的表达情况，旨在探讨绝经对三阴性乳腺癌发生的影响。 方法 选择绝经前及绝经后各8例经病理确诊的三阴性乳腺癌患者，应用iTRAQ技术分析差异蛋白显著性功能、差异蛋白pathway并进行差异蛋白验证。 结果 （1）绝经前差异蛋白相互作用组较集中，而绝经后的差异蛋白较多，且分布较散。（2）绝经前癌组织的差异蛋白存在于5种差异显著途径中；绝经后癌组织的差异蛋白存在于15种差异显著途径中。（3）与癌旁组织相比，绝经前共有214种显著差异蛋白，绝经后共有360种显著差异蛋白。绝经前的三阴性乳腺癌组织中上调蛋白81种，下调蛋白133种，绝经后上调蛋白157种类，下调203种。 结论 利用iTRAQ技术发现，绝经前后三阴性乳腺癌患者差异蛋白表达具有一定的特殊性，说明不同雌激素环境下三阴性乳腺癌可能存在不同发病机制，可能成为治疗TNBC的新靶点。
[关键词] 三阴性乳腺癌；绝经前后； iTRAQ技术；差异蛋白
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）02-0001-04
三阴性乳腺癌（TNBC）是指孕激素受体（progesterone receptor，PR）、雌激素受体（estrogen receptor，ER）和人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）均为阴性表达的乳腺癌，其多发于初潮及足月怀孕年龄早、哺乳期短，特别是绝经前的妇女[1]。目前手术、化疗及新辅助化疗和靶向治疗为常用治疗TNBC方法。其中分子靶向治疗以肿瘤细胞的特征性改变为作用靶点，在发挥更强的抗肿瘤作用的同时减少对正常细胞的毒副作用。目前TNBC治疗靶点的筛查工作已取得了一定的研究进展，其中差异蛋白质组学的方法被认为是目前筛选TNBC临床治疗靶点最为有效的研究方法之一。差异蛋白质组学的方法主要包括双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、高效液相色谱技术、应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术等分离技术及质谱鉴定技术[2]。近年来人们对iTRAQ技术的应用日渐开展起来，然而将iTRAQ技术应用于三阴性乳腺癌机制研究及靶向位点的探讨至今仍较少。本研究以绝经前和绝经后三阴性乳腺癌患者癌组织和癌旁正常组织为实验材料，利用iTRAQ技术分析绝经前和绝经后三阴性乳腺癌和癌旁正常组织蛋白差异表达谱，进而分析绝经前和绝经后差异蛋白的特异性，旨在探讨绝经对三阴性乳腺癌发生产生的影响，从而为三阴性乳腺癌的治疗提供依据。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选择2013年1月～2014年1月间我院收治的绝经前及绝经后各8例经病理确诊的三阴性乳腺癌患者，病理类型均为导管腺癌。绝经前8例TNBC患者的年龄范围为40～53岁。绝经后8例TNBC患者的年龄范围为59～81岁。16例三阴性乳腺癌患者的病例资料见表1。
1.2 实验过程
1.2.1 SDS-PAGE （1）组织标本处理：取术后新鲜的乳腺癌组织及距肿瘤5 cm以上的癌旁正常乳腺组织，切成小块，称重，分装，置-80℃的低温冰箱中保存备用。（2）总蛋白制备：①取50 μg低温冷冻的样品置于液氮预冷的研钵中，边加入液氮边研磨，直至样品呈现白色粉末状，收集到1.5 mL的EP管中。②加入500 μL LS，振荡器混匀，超声波破碎，重复3次，每次间隔3 min。③置冰上1 h，并间歇震荡。④4℃，15 000 rpm离心30 min，重复2次，样品分层后用移液器小心地将中层清液吸出放入1.5 mL EP管中。⑤向中清液加入丙酮/甲醛沉淀液，冰上沉淀2 h。⑥4℃，15 000 rpm离心20 min，弃上清，加入1 mL 100%丙酮，置于-20℃冰箱中沉淀1 h。⑦加入80%丙酮1 mL，-20℃冰箱中沉淀1 h，4℃，15 000 rpm离心15 min，留取沉淀，在空气中晾干。⑧将250 μL 加入RS晾干沉淀，涡旋振荡器上混匀，30℃金属浴中孵育1 h。⑨4℃，15 000 rpm离心10 min，留取上清，即为组织总蛋白溶液。（3）总蛋白浓度测定：①准备两组8个1.5 mL离心管，每管各加入0、5、7.5、10、12.5、15、17.5和20 μL 0.5 mg/mL牛血清白蛋白，再分别加入20、15、12.5、10、 7.5、5、2.5、0 μL蛋白溶解液，再加入80 μL 0.15 mmol/L NaCl，以1号管不含牛血清白蛋白的作空白对照。②每管各加入1 mL考马斯亮蓝染料溶液。③比色测OD595。（4）SDS-PAGE：①准备SDS-PAGE凝胶。②将样品与SDS样品缓冲液混合，同样准备蛋白质分子量标准物。③上样：取15 μL蛋白样品上样，12% SDS-PAGE电泳，电极缓冲液为Tris-甘氨酸电泳缓冲液。按次序上样，一定安排已知分子量的标准物。④电泳。⑤取下凝胶，考马斯亮蓝或银染色染色观察分析。
1.2.2 酶解及iTRAQ标记 （1）样品处理：每组取120 μg样品于30 μL SDT溶液，沸水浴5 min，冷却至室温。加入200 μL UA溶液混匀，转入30 kd超滤离心管，离心14000 g 15 min。加入200 μL UA溶液，离心14000 g 15 min，弃滤液。加入100 μL IAA，600 rpm振荡1 min，避光室温30 min，离心14000 g 10 min。加入100 μL UA溶液，离心14000 g 10 min重复2次。加入100 μL 25 mM NH4HCO3，离心14000 g 10 min重复2次。加入40 μL Trypsin buffer 600 rpm振荡1 min，37℃ 16～18 h。换新收集管，离心14000 g 10 min，收集滤液。（2）蛋白质含量测定：同1.2.1。（3）同位素标记：从每组取等量肽段（约100 μg），按照试剂盒说明书进行标记。 1.2.3 肽段的分离及鉴定 分别进行强阳离子交换层析分级分离、毛细管高效液相色谱分离、ESI质谱鉴定。
1.3 数据分析及处理
（1）质谱数据分析：原始文件用iTRAQ Result Multiple File Distiller分析定量数据，并用Sequest软件鉴定多肽分子。定量方法采用Identified iTRAQ Statistic Builder软件分析，依据同位素报告基因的相对含量进行蛋白质定量。（2）生物信息学分析：分析差异蛋白在Gene Ontology数据库中的分布状况，利用Cluster软件进行蛋白功能注释，基于KEGG数据库对差异蛋白基因进行通路注释，得到差异蛋白基因所参与的所有的通路，利用Fisher精确检验计算每个通路的显著性水平，并对多重假设检验的结果进行校正并获得误判率，从而筛选出差异基因参与的显著通路[3]。
2 结果
2.1 绝经前后的TNBC患者差异蛋白显著性功能分析
绝经前在已鉴定的差异量2倍以上的214种蛋白中，具有Go注释的有89种，其中12种蛋白参与小分子代谢，10种蛋白参与细胞粘附，7种参与炎症反应，7种参与调节基因表达。见封三图1。绝经后已鉴定的差异量2倍以上的360种蛋白中，具有Go注释的有156种，其中24种蛋白参与小分子代谢，12种蛋白参与细胞粘附，8种参与炎症反应，15种参与调节基因表达，12种具有信号转导功能，3种参与凋亡反应，17种发挥转运功能，20种参与血液凝固，2种参与细胞内蛋白代谢过程，见封三图2。将绝经前和绝经后显著差异蛋白整理绘制相互作用图谱，发现绝经前差异蛋白相互作用组较集中，而绝经后的差异蛋白较多，且分布较散。见封三图3、4。
2.2 绝经前后的TNBC患者差异蛋白Pathway分析
基于KEGG数据库对差异基因进行Pathway注释，得到差异基因所参与的所有途径。绝经前有ECM-受体相互作用、蛋白质消化吸收、肾素-血管紧张素系统、互补及凝固级联反应和聚集粘附这5种途径为差异基因显著参与的途径。绝经后具有15种特异的Pathway，差异蛋白参与的途径包括粘着斑、在内质网内的蛋白质加工、丙酮酸的新陈代谢、PPAR信号通路、谷胱甘肽新陈代谢、葡萄球菌感染、核糖体、糖酵解、糖异生、补体、苯丙氨酸代谢、吞噬作用等。
2.3 绝经前后的TNBC患者差异蛋白验证分析
采用iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，并可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10 kD或大于200 kD的蛋白。结果显示，在绝经前后两组共鉴定1254种蛋白质，其中1243种有定量信息。选择表达量差异2倍以上的作为显著差异蛋白，与乳腺癌旁组织相比，绝经前（premenopause）共有214种显著差异蛋白，绝经后（Hpost-menopauseH）共有360种显著差异蛋白（表2）。
表2 绝经前后TNBC患者显著差异蛋白（与乳腺癌旁组织相比）（个）
3 讨论
三阴性乳腺癌其发病及致病机制比较复杂，激素环境一直被认为是TNBC致病潜在重要的影响因子之一[7]。经期是激素变化的显著阶段，绝经前与绝经后体内激素发生很大的变化，其中雌激素越多，绝经女性患某些乳腺癌的几率相对越大[4]。目前，尚无绝经与TNBC关系的研究报道，是否绝经对三阴性乳腺癌发生具有影响，绝经前后不同激素水平条件下三阴性乳腺癌发生的机制是否存在差异，至今未知。
三阴性乳腺癌的治疗目前还没有一个明确的、行之有效的靶向治疗单剂，其中分子靶向治疗是目前治疗癌症的有效手段，且TNBC的治疗靶点的筛查工作已取得了一定的研究进展，其中差异蛋白质组学的方法被认为目前筛选临床治疗靶点最为有效的研究方法之一[5]。差异蛋白质组学的方法主要包括双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、高效液相色谱技术、应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术等分离技术及质谱鉴定技术。由于凝胶电泳仍具有低灵敏度、无法检测低丰度蛋白的局限，因此近期人们比较关注同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术的应用[6-8]。与凝胶为基础的定量方法比较，iTRAQ技术可捕获全蛋白、且无需凝胶电泳、同时可进行多样品分析，从而成为研究三阴性乳腺癌靶向位点的有力手段之一[9，10]。然而iTRAQ技术应用到三阴性乳腺癌机制研究及靶向位点的探索至今仍较少。iTRAQ技术是采用4种或8种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。Leroi D等[11]采用iTRAQ技术探讨子宫内膜癌的差异蛋白，并发现chaperonin 10，pyruvate kinase M1 or M2 isozyme，calgizzarin等9种蛋白可以作为潜在的靶向治疗位点。
本研究应用iTRAQ技术结合2D LC-MS/MS，在绝经前和绝经后两组中共鉴定1254种蛋白质，其中1243种有定量信息。选择表达量差异2倍以上的作为显著差异蛋白，与癌旁组织相比，绝经前共有214种显著差异蛋白，绝经后共有360种显著差异蛋白。其中与癌旁组织相比，绝经前的三阴性乳腺癌组织中上调蛋白81种，下调蛋白133种，绝经后上调蛋白157种类，下调203种，绝经前后差异蛋白表达并不完全一致，说明绝经前后TNBC患者的蛋白表达情况具有一定的差异性及特殊性。在这些差异表达的蛋白中，有一些功能尚不十分清楚，而有一些与肿瘤密切相关。且本研究将绝经前和绝经后显著差异蛋白整理绘制相互作用图谱（封三图3、4），结果显示，绝经前差异蛋白相互作用组较集中，而绝经后的差异蛋白较多，且分布较散。同时我们对绝经前后的TNBC患者差异蛋白的通路分析显示：绝经前癌组织的差异蛋白存在于5种差异显著途径中；绝经后癌组织的差异蛋白存在于15种差异显著途径中。绝经前后的TNBC患者共同存在的差异蛋白主要体现在三条显著途径，分别为ECM-受体相互作用途经、蛋白质消化吸收、肾素-血管紧张素系统，而绝经后也有独特的差异显著通路，推测以绝经为界限，绝经前和绝经后的TNBC具有不同的致病机制[12]。共同的通路是三阴性乳腺癌的共性致病调控途径，而绝经后仍存在12种调控途径，包括粘着斑、在内质网内的蛋白质加工、丙酮酸的新陈代谢、PPAR信号通路、谷胱甘肽新陈代谢、葡萄球菌感染、核糖体、糖酵解、糖异生、补体、苯丙氨酸代谢、吞噬作用等相关蛋白，具有一定特性，因此根据绝经前后致病机制的不同，可以选择不同的治疗方案，为针对性治疗三阴性乳腺癌指明方向。 总之，本研究中我们应用iTRAQ技术对绝经前后三阴性乳腺癌及癌旁正常组织的蛋白质组进行比较分析，确定了差异表达的蛋白，并对这些蛋白进行了功能分析，确定了这些差异蛋白显著参与的信号转导途径，但这些差异蛋白在绝经前后三阴性乳腺癌具体通过什么机制、如何发挥作用还需要继续进行大样本进一步深入地研究。
[参考文献]
[1] 沈镇宙，邵志敏. 乳腺肿瘤学[M]. 上海：上海科技出版社，2005：1-2.
[2] Perou CM，Sodie T，Eisen MB，et al. Molecular portraits of human breast tumours. [J]. Nature，2000，406：747-752.
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[10] 杨德宏，刘红，赵晶. 三阴型乳腺癌临床病理特征及预后分析[J]. 中国肿瘤临床，2008，35（9）：501-504.
[11] Leroi De Souza， Georg Diehl， Mary Joe Rodrigues， et al. Search for cancer markers from endometrial tissues using differentially labeled tags iTRAQ and cICAT with multidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry[J]. Journal of Proteome Research，2005，4（2）：377-386.
[12] Charles F，Streckfus， Otilia Mayorga-Wark， et al. Breast cancer related proteins are present in saliva and are modulated secondary to ductal carcinoma in situ of the breast[J]. Cancer Investigation，2008，26（2）：159-167.
（收稿日期：2014-10-30）
[关键词] 三阴性乳腺癌；绝经前后； iTRAQ技术；差异蛋白
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）02-0001-04
三阴性乳腺癌（TNBC）是指孕激素受体（progesterone receptor，PR）、雌激素受体（estrogen receptor，ER）和人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）均为阴性表达的乳腺癌，其多发于初潮及足月怀孕年龄早、哺乳期短，特别是绝经前的妇女[1]。目前手术、化疗及新辅助化疗和靶向治疗为常用治疗TNBC方法。其中分子靶向治疗以肿瘤细胞的特征性改变为作用靶点，在发挥更强的抗肿瘤作用的同时减少对正常细胞的毒副作用。目前TNBC治疗靶点的筛查工作已取得了一定的研究进展，其中差异蛋白质组学的方法被认为是目前筛选TNBC临床治疗靶点最为有效的研究方法之一。差异蛋白质组学的方法主要包括双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、高效液相色谱技术、应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术等分离技术及质谱鉴定技术[2]。近年来人们对iTRAQ技术的应用日渐开展起来，然而将iTRAQ技术应用于三阴性乳腺癌机制研究及靶向位点的探讨至今仍较少。本研究以绝经前和绝经后三阴性乳腺癌患者癌组织和癌旁正常组织为实验材料，利用iTRAQ技术分析绝经前和绝经后三阴性乳腺癌和癌旁正常组织蛋白差异表达谱，进而分析绝经前和绝经后差异蛋白的特异性，旨在探讨绝经对三阴性乳腺癌发生产生的影响，从而为三阴性乳腺癌的治疗提供依据。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选择2013年1月～2014年1月间我院收治的绝经前及绝经后各8例经病理确诊的三阴性乳腺癌患者，病理类型均为导管腺癌。绝经前8例TNBC患者的年龄范围为40～53岁。绝经后8例TNBC患者的年龄范围为59～81岁。16例三阴性乳腺癌患者的病例资料见表1。
1.2 实验过程
1.2.1 SDS-PAGE （1）组织标本处理：取术后新鲜的乳腺癌组织及距肿瘤5 cm以上的癌旁正常乳腺组织，切成小块，称重，分装，置-80℃的低温冰箱中保存备用。（2）总蛋白制备：①取50 μg低温冷冻的样品置于液氮预冷的研钵中，边加入液氮边研磨，直至样品呈现白色粉末状，收集到1.5 mL的EP管中。②加入500 μL LS，振荡器混匀，超声波破碎，重复3次，每次间隔3 min。③置冰上1 h，并间歇震荡。④4℃，15 000 rpm离心30 min，重复2次，样品分层后用移液器小心地将中层清液吸出放入1.5 mL EP管中。⑤向中清液加入丙酮/甲醛沉淀液，冰上沉淀2 h。⑥4℃，15 000 rpm离心20 min，弃上清，加入1 mL 100%丙酮，置于-20℃冰箱中沉淀1 h。⑦加入80%丙酮1 mL，-20℃冰箱中沉淀1 h，4℃，15 000 rpm离心15 min，留取沉淀，在空气中晾干。⑧将250 μL 加入RS晾干沉淀，涡旋振荡器上混匀，30℃金属浴中孵育1 h。⑨4℃，15 000 rpm离心10 min，留取上清，即为组织总蛋白溶液。（3）总蛋白浓度测定：①准备两组8个1.5 mL离心管，每管各加入0、5、7.5、10、12.5、15、17.5和20 μL 0.5 mg/mL牛血清白蛋白，再分别加入20、15、12.5、10、 7.5、5、2.5、0 μL蛋白溶解液，再加入80 μL 0.15 mmol/L NaCl，以1号管不含牛血清白蛋白的作空白对照。②每管各加入1 mL考马斯亮蓝染料溶液。③比色测OD595。（4）SDS-PAGE：①准备SDS-PAGE凝胶。②将样品与SDS样品缓冲液混合，同样准备蛋白质分子量标准物。③上样：取15 μL蛋白样品上样，12% SDS-PAGE电泳，电极缓冲液为Tris-甘氨酸电泳缓冲液。按次序上样，一定安排已知分子量的标准物。④电泳。⑤取下凝胶，考马斯亮蓝或银染色染色观察分析。
1.2.2 酶解及iTRAQ标记 （1）样品处理：每组取120 μg样品于30 μL SDT溶液，沸水浴5 min，冷却至室温。加入200 μL UA溶液混匀，转入30 kd超滤离心管，离心14000 g 15 min。加入200 μL UA溶液，离心14000 g 15 min，弃滤液。加入100 μL IAA，600 rpm振荡1 min，避光室温30 min，离心14000 g 10 min。加入100 μL UA溶液，离心14000 g 10 min重复2次。加入100 μL 25 mM NH4HCO3，离心14000 g 10 min重复2次。加入40 μL Trypsin buffer 600 rpm振荡1 min，37℃ 16～18 h。换新收集管，离心14000 g 10 min，收集滤液。（2）蛋白质含量测定：同1.2.1。（3）同位素标记：从每组取等量肽段（约100 μg），按照试剂盒说明书进行标记。 1.2.3 肽段的分离及鉴定 分别进行强阳离子交换层析分级分离、毛细管高效液相色谱分离、ESI质谱鉴定。
1.3 数据分析及处理
（1）质谱数据分析：原始文件用iTRAQ Result Multiple File Distiller分析定量数据，并用Sequest软件鉴定多肽分子。定量方法采用Identified iTRAQ Statistic Builder软件分析，依据同位素报告基因的相对含量进行蛋白质定量。（2）生物信息学分析：分析差异蛋白在Gene Ontology数据库中的分布状况，利用Cluster软件进行蛋白功能注释，基于KEGG数据库对差异蛋白基因进行通路注释，得到差异蛋白基因所参与的所有的通路，利用Fisher精确检验计算每个通路的显著性水平，并对多重假设检验的结果进行校正并获得误判率，从而筛选出差异基因参与的显著通路[3]。
2 结果
2.1 绝经前后的TNBC患者差异蛋白显著性功能分析
绝经前在已鉴定的差异量2倍以上的214种蛋白中，具有Go注释的有89种，其中12种蛋白参与小分子代谢，10种蛋白参与细胞粘附，7种参与炎症反应，7种参与调节基因表达。见封三图1。绝经后已鉴定的差异量2倍以上的360种蛋白中，具有Go注释的有156种，其中24种蛋白参与小分子代谢，12种蛋白参与细胞粘附，8种参与炎症反应，15种参与调节基因表达，12种具有信号转导功能，3种参与凋亡反应，17种发挥转运功能，20种参与血液凝固，2种参与细胞内蛋白代谢过程，见封三图2。将绝经前和绝经后显著差异蛋白整理绘制相互作用图谱，发现绝经前差异蛋白相互作用组较集中，而绝经后的差异蛋白较多，且分布较散。见封三图3、4。
2.2 绝经前后的TNBC患者差异蛋白Pathway分析
基于KEGG数据库对差异基因进行Pathway注释，得到差异基因所参与的所有途径。绝经前有ECM-受体相互作用、蛋白质消化吸收、肾素-血管紧张素系统、互补及凝固级联反应和聚集粘附这5种途径为差异基因显著参与的途径。绝经后具有15种特异的Pathway，差异蛋白参与的途径包括粘着斑、在内质网内的蛋白质加工、丙酮酸的新陈代谢、PPAR信号通路、谷胱甘肽新陈代谢、葡萄球菌感染、核糖体、糖酵解、糖异生、补体、苯丙氨酸代谢、吞噬作用等。
2.3 绝经前后的TNBC患者差异蛋白验证分析
采用iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，并可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10 kD或大于200 kD的蛋白。结果显示，在绝经前后两组共鉴定1254种蛋白质，其中1243种有定量信息。选择表达量差异2倍以上的作为显著差异蛋白，与乳腺癌旁组织相比，绝经前（premenopause）共有214种显著差异蛋白，绝经后（Hpost-menopauseH）共有360种显著差异蛋白（表2）。
表2 绝经前后TNBC患者显著差异蛋白（与乳腺癌旁组织相比）（个）
3 讨论
三阴性乳腺癌其发病及致病机制比较复杂，激素环境一直被认为是TNBC致病潜在重要的影响因子之一[7]。经期是激素变化的显著阶段，绝经前与绝经后体内激素发生很大的变化，其中雌激素越多，绝经女性患某些乳腺癌的几率相对越大[4]。目前，尚无绝经与TNBC关系的研究报道，是否绝经对三阴性乳腺癌发生具有影响，绝经前后不同激素水平条件下三阴性乳腺癌发生的机制是否存在差异，至今未知。
三阴性乳腺癌的治疗目前还没有一个明确的、行之有效的靶向治疗单剂，其中分子靶向治疗是目前治疗癌症的有效手段，且TNBC的治疗靶点的筛查工作已取得了一定的研究进展，其中差异蛋白质组学的方法被认为目前筛选临床治疗靶点最为有效的研究方法之一[5]。差异蛋白质组学的方法主要包括双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、高效液相色谱技术、应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术等分离技术及质谱鉴定技术。由于凝胶电泳仍具有低灵敏度、无法检测低丰度蛋白的局限，因此近期人们比较关注同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术的应用[6-8]。与凝胶为基础的定量方法比较，iTRAQ技术可捕获全蛋白、且无需凝胶电泳、同时可进行多样品分析，从而成为研究三阴性乳腺癌靶向位点的有力手段之一[9，10]。然而iTRAQ技术应用到三阴性乳腺癌机制研究及靶向位点的探索至今仍较少。iTRAQ技术是采用4种或8种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。Leroi D等[11]采用iTRAQ技术探讨子宫内膜癌的差异蛋白，并发现chaperonin 10，pyruvate kinase M1 or M2 isozyme，calgizzarin等9种蛋白可以作为潜在的靶向治疗位点。
本研究应用iTRAQ技术结合2D LC-MS/MS，在绝经前和绝经后两组中共鉴定1254种蛋白质，其中1243种有定量信息。选择表达量差异2倍以上的作为显著差异蛋白，与癌旁组织相比，绝经前共有214种显著差异蛋白，绝经后共有360种显著差异蛋白。其中与癌旁组织相比，绝经前的三阴性乳腺癌组织中上调蛋白81种，下调蛋白133种，绝经后上调蛋白157种类，下调203种，绝经前后差异蛋白表达并不完全一致，说明绝经前后TNBC患者的蛋白表达情况具有一定的差异性及特殊性。在这些差异表达的蛋白中，有一些功能尚不十分清楚，而有一些与肿瘤密切相关。且本研究将绝经前和绝经后显著差异蛋白整理绘制相互作用图谱（封三图3、4），结果显示，绝经前差异蛋白相互作用组较集中，而绝经后的差异蛋白较多，且分布较散。同时我们对绝经前后的TNBC患者差异蛋白的通路分析显示：绝经前癌组织的差异蛋白存在于5种差异显著途径中；绝经后癌组织的差异蛋白存在于15种差异显著途径中。绝经前后的TNBC患者共同存在的差异蛋白主要体现在三条显著途径，分别为ECM-受体相互作用途经、蛋白质消化吸收、肾素-血管紧张素系统，而绝经后也有独特的差异显著通路，推测以绝经为界限，绝经前和绝经后的TNBC具有不同的致病机制[12]。共同的通路是三阴性乳腺癌的共性致病调控途径，而绝经后仍存在12种调控途径，包括粘着斑、在内质网内的蛋白质加工、丙酮酸的新陈代谢、PPAR信号通路、谷胱甘肽新陈代谢、葡萄球菌感染、核糖体、糖酵解、糖异生、补体、苯丙氨酸代谢、吞噬作用等相关蛋白，具有一定特性，因此根据绝经前后致病机制的不同，可以选择不同的治疗方案，为针对性治疗三阴性乳腺癌指明方向。 总之，本研究中我们应用iTRAQ技术对绝经前后三阴性乳腺癌及癌旁正常组织的蛋白质组进行比较分析，确定了差异表达的蛋白，并对这些蛋白进行了功能分析，确定了这些差异蛋白显著参与的信号转导途径，但这些差异蛋白在绝经前后三阴性乳腺癌具体通过什么机制、如何发挥作用还需要继续进行大样本进一步深入地研究。
[参考文献]
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（收稿日期：2014-10-30）