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摘 要：本文对贵州省19科26属30种林木树种植物ITS序列进行PCR扩增及测序，用MEGA 5.0软件对序列进行比对分析序列信息，用最近距离法计算种内及种间遗传距离，通过邻接法构建系统发育树。结果表明，供试树种的DNA总长度为506～684 bp，其中平均G+C含量为64%，种内平均遗传距离为0.013，种间平均遗传距离为0.236;基于ITS序列构建的聚类树显示，对30种林木树种的鉴定成功率为83%，因此，推荐ITS序列作为林木树种DNA条形码的候选序列。
关键词：林木树种;DNA条形码;ITS;鉴定
中图分类号：R282
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2018）06-0031-05 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.006
核糖体DNA（nrDNA）内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）是位于18S与5.8S间、5.8S与26S间的基因间区，称为ITS1和ITS2区[1-2]。因为其进化速度快、序列变异丰富、提供丰富的变异位点和信息位点，而被广泛用于属间、种间、不同居群间等较低分类阶元上的亲缘关系和系统进化研究，能为植物系统分类及鉴定提供参考依据[3]。
DNA条形码是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断新技术[4-5]，该技术由加拿大圭尔夫大学（University of Guelph） 教授Hebert等[6]于2003年首次提出，近年来受到广泛的关注，已成为生物分类和鉴定的热点[7]。当前，线粒体COI 基因序列已作为通用条形码在动物物种鉴定得到广泛认可[8]，而在植物领域，科学家分别提出了ITS2[9]和psbA-trnH[10]、rbcL[11]、matK[12]、trnL[13]等序列片段，以及不同序列组合作为植物DNA条形码序列，但由于自然界植物种群的复杂性，仍没有找到一种适用于所有类群最理想的DNA通用条形码[14]。
目前，有关植物条形码研究主要集中在中药材等草本植物及真菌类药用植物的鉴定，涉及林木树种的研究较少。自2010年以来，Chen等[9]对4800种6600份药用植物样本的psbA-trnH、matK、rbcL、rpoC1、ycf5、ITS2及ITS等 7個序列，进行DNA条形码序列筛选，首次提出了ITS2作为药用植物DNA条形码的候选序列;张嘉丽等[15]对真菌类药材马勃（Lasiosphaeracalvatia）及其混伪品的DNA条形码研究表明，基于ITS序列的条形码技术可以将马勃药材及其混伪品有效进行鉴别;Tripathi等[16]通过对印度热带树种的DNA条形码筛选研究表明，ITS序列对热带树种的鉴定成功率为24.4%～74.3%;Fladung等[17]对墨西哥桉属（Eucalyptus）植物的DNA条形码研究表明，ITS序列较叶绿体序列能更好的鉴定桉属植物。为了把DNA条形码技术更好的利用在木本植物分类及鉴定中，本文基于ITS序列对贵州省30种林木树种进行分类鉴定，30种林木树种材料的选取为贵州地区社会价值较高或濒危物种，旨在为林木树种的鉴定及濒危树种的保护提供分子理论基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试林木树种植物名称及来源见表1，30种林木树种植物包括 19 科 26 属。取植株新鲜的叶片作为材料，叶片采下后立刻装入硅胶干燥，每个样品均采集3株以上的植物叶片作为平行样品且单株间隔在50 m以上。
1.2 DNA提取、扩增及测序
基因组DNA的提取参照Doyle等[18]CTAB法并稍作改动，ITS序列扩增引物参照Wendel等[19]设计的通用引物P1：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，P2：5′-TCCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。PCR扩增试剂采用Tiangen公司的2*Taq PCR MasterMix，PCR扩增具体程序为：94°C预变性4 min;94°C变性1 min;53.6°C退火45 s，72°C延伸1min;36个循环，72°C延伸7 min，4°C保存。测序采用双向测序，由上海立菲生物技术有限公司完成。
1.3 序列分析及系统树构建
用DNAstar软件对正反向序列拼接并手工矫正错误碱基，用MEGA 5.0软件对拼接后的序列进行比对并构建矩阵，并采用最近距离法（K2P nearest distance）计算种内及种间遗传距离，用Excel绘制种内及种间的遗传距离频率分布图。用MEGA 6.0软件采用邻接法（Neighbor Joining，NJ）对序列构建NJ树，序列矩阵中所有的碱基同等加权，空位采用缺失处理，自举法（Bootstrap）重复1000次检验可信度，各分支上的树值代表自展支持率。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果及序列分析
部分林木树种PCR扩增电泳，PCR产物条带清晰，扩增成功率较好，产物符合ITS序列长度（600～800 bp）。用MEGA 5.0软件对序列分析表明，30种林木树种ITS序列总长度为506～684 bp，有593个变异位点，555个信息位点，包括碱基之间的转换和颠换，碱基转换与颠换比为1.11，其中平均G+C含量为64%，由此可见，30种林木树种碱基的变异较大。
2.2 种内及种间遗传距离分析
用MEGA 5.0软件采用K2P模型对30种林木树种的种内及种间的遗传距离分析，结果表明，种内平均遗传距离为0.013，其中垂柳的种内遗传距离最大（0.199）;种间平均遗传距离为0.236，其中马缨杜鹃与露珠杜鹃及大白杜鹃、露珠杜鹃与大白杜鹃、华中樱与樱桃之间的遗传距离均为0，垂柳与女贞之间的遗传距离最大（0.51）。由此可见，ITS序列在种内的遗传距离都较小，种间的遗传距离均较大，满足理想DNA条形码的要求。 2.3 序列的barcoding gap评估
通过对ITS序列遗传距离的Barcoding Gap图可以看出，nrITS序列的Barcoding Gap位置在0.1～0.2之間，种内遗传距离大部分集中在0.02以下区域，而种间遗传距离多集中于0.2～0.4之间，种内遗传距离与种间遗传距离存在部分重叠现象，但重叠部分中，两者所占的比例都不高，由此可见，种内与种间的遗传距离频率分布差异明显，满足理想的DNA条形码中种内遗传距离小、种间遗传距离大等特点。
2.4 系统聚类分析
基于nrITS序列对30种林木树种的聚类分析结果表明，不同种的林木植物总体上能较好的区分开，且同一种林木树种的三个平行都能较好的聚为一支，且自展支持率均高于70%，但杜鹃属中的马缨杜鹃、大白杜鹃、羊踟蹰以及露珠杜鹃中的部分种混合聚合3支，樱属中的华中樱桃和樱桃共同聚为一支，不能较好的分开，表明基于ITS对30种林木树种的鉴定成功率为83%。
3 结论与讨论
DNA条形码技术（DNA barcoding）是用短的DNA片段对物种进行识别和鉴定的分子生物学技术[20]，该技术作为一种分子诊断已被普遍应用到物种鉴定[21-22]，其结果客观性强且操作较简便，大大提高了非专业人员进行物种鉴定的效率和准确性，成为分类学家非常有力的工具[23]。理想的条形码基因片段应该满足以下几个特点：（1）种间变异明显大于种内变异;（2）一个或少数基因片段即可准确鉴定物种;（3）重复性好;（4）稳定性高;（5）操作简便，可实现自动化;（6）有统一的管理平台等[24-25]。本研究结果表明，核糖体ITS序列扩增及测序成功率都高，序列在Genbank中Blast比对时对物种的鉴定成功率较好，且NJ法构建的系统发育树能区分大部分物种，满足理想的DNA条形码要求，故推荐ITS序列作为林木树种的DNA条形码候选序列之一。
就遗传距离而言，本研究中的30种物种的种内遗传距离均很小，种间的遗传距离总体上都很大，表明ITS在林木树种植物的进化速率符合种内进化小、种间进化大的要求。从系统发育进化树来看，在杜鹃属的5种植物中，仅有百合花杜鹃能独立聚为一支，而其他4种杜鹃植物共同聚为3支，且种间平行样本出现交叉现象;同时在蔷薇科（Rosaceae）樱属（Cerasus）的华中樱（Cerasusconradinae）和樱桃（Cerasuspseudocerasus）两种植物共同聚为一支，不能区分开，存在的原因可能与物种的鉴定及nrITS基因在该种植物中进化速率存在一定的关系[26]。同时在30种林木树种中同一科的不同植物聚为一支，如木犀科（Oleaceae）的女贞（Ligustrumlucidum）和木犀（Osmanthusfragrans），蔷薇科（Rosaceae）中的杏（Armeniaca vulgaris）、枇杷（Eriobotrya japonica）及桃（Amygdaluspersica），槭树科（Aceraceae）的三角槭（Acer buergerisnum）和贵州槭（Acer guizhoueuse）都分别聚为一支，支持率均大于90%，表明ITS 序列对属级以上的林木树种具有较高的分辨率，且对物种的系统发育具有一定的参考价值。
参 考 文 献：
[1] Meerow A W，Guy C L，Li Q B，et al.Phylogeny of the American Amaryllidaceae based on nrDNA ITS sequences[J].Systematic Botany，2000，25（2000）：708-726.
[2] Miao M，Warren A，Song W，et al.Analysis of the internal transcribed spacer 2 （ITS2） region of scuticociliates and related taxa （Ciliophora：Oligohymenophorea） to infer their evolution and phylogeny[J].Protist，2008，159（4）：519-533.
[3] 刘美子，宋经元，罗 焜，等.DNA条形码序列对9种蒿属药用植物的鉴定[J].中草药，2012，43（7）：1393-1397.
[4] 朱英杰，陈士林，姚 辉，等.重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究[J].药学学报，2010，45（3）：376-382.
[5] 庞晓慧，宋经元，陈士林.应用DNA条形码技术鉴定中药材灯心草[J].中国中药杂志，2012，37（8）：1097-1099.
[6] Paul D.N.H，Sujeevan R，Jeremy R.D W.Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].Proceedings Biological Sciences，2003，270（S1）：S96.
[7] Gregory T R.DNA barcoding does not compete with taxonomy[J].Nature，2005，434（434）：1067.
[8] Iftikhar R，Ashfaq M，Rasool A，et al.DNA Barcode Analysis of Thrips （Thysanoptera） Diversity in Pakistan Reveals Cryptic Species Complexes[J].PLos One，2016，11（1），e0146014. [9] Chen S L，Yao H，Han J P，et al.Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J].PLoS One，2010（5）：e8613.
[10] Kress W J，Wurdack K J，Zimmer E A，et al.Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2005，102（23）：8369-8374.
[11] Newmaster S G，Fazekas A J，Ragupathy S.DNA barcoding in land plants：evaluation of rbcL in a multigene tiered approach[J].Canadian Journal of Botany，2006，84（3）：335-341.
[12] Lahaye R，Vand B M，Bogarin D，Warner J，et al.DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2008，105（8）：2923-2928.
[13] Taberlet P，Coissac E，Pompanon F，et al.Power and limitations of the chloroplast trnL （UAA） intron for plant DNA barcoding[J].Nucleic Acids Research，2007，35（3）：e14.
[14] Pettengill J B，Neel M C.An evaluation of candidate plant DNA barcodes and assignment methods in diagnosing 29 species in the genus Agalinis （Orobanchaceae）[J]. American Journal of Botany，2010，97（8）：1391-1406.
[15] 張嘉丽，黄宇航，宋 明，等.基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品[J].世界中医药，2016，11（5）：777-780+785.
[16] Abhinandan M T，Antariksh T，Anoop K，et al.The internal transcribed spacer （ITS） region and trnhH-psbA are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India[J].PLos One，2013，8（2）：e57934-e57934.
[17] Fladung M，Schoeder H，Wehenkel C，et al.Differentiation of six Eucalyptus trees grown in Mexico by ITS and six chloroplast barcoding markers[J].Silvae Genetica，2015，64（3）：121-130.
[18] Doyle J.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemical Bulletin，1987（19）：11-15.
[19] Wendel J F，Schnabel A，Seelanan T.Bidirectional interlocus concerted evolution following allopolyploid speciation in cotton[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1995（1）：280-284.
[20] 闫化学，于 杰.DNA条形码技术在植物中的研究现状[J].植物学报，2010，45（1）：102-108.
[21] Taberlet P，Coissac E，Pompanon F，et al.Power and limitations of the chloroplast trnL （UAA） intron for plant DNA barcoding[J].Nucleic Acids Research，35（3）：e14.
[22] Kress W J，Erickson D L.A two-locus global DNA barcode for land plants：the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region[J].PLos One，2007，2（6）：e508.
[23] Fazekas A J，Burgess K S，Kesanakurti P R，et al.Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well[J].PLoS One， 2008，3（7）：e2802.
[24] Slabbinck B，Dawyndt P，Martens M， et al.TaxonGap：a visualization tool for intra-and inter-species variation among individual biomarkers[J].Bioinformatics，2008，24（6）：866-867.
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[26] 程希婷，王爱民，顾志峰，等.DNA条形码研究进展[J].基因组学与应用生物学，2011，30（6）：748-758.
关键词：林木树种;DNA条形码;ITS;鉴定
中图分类号：R282
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DNA条形码是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断新技术[4-5]，该技术由加拿大圭尔夫大学（University of Guelph） 教授Hebert等[6]于2003年首次提出，近年来受到广泛的关注，已成为生物分类和鉴定的热点[7]。当前，线粒体COI 基因序列已作为通用条形码在动物物种鉴定得到广泛认可[8]，而在植物领域，科学家分别提出了ITS2[9]和psbA-trnH[10]、rbcL[11]、matK[12]、trnL[13]等序列片段，以及不同序列组合作为植物DNA条形码序列，但由于自然界植物种群的复杂性，仍没有找到一种适用于所有类群最理想的DNA通用条形码[14]。
目前，有关植物条形码研究主要集中在中药材等草本植物及真菌类药用植物的鉴定，涉及林木树种的研究较少。自2010年以来，Chen等[9]对4800种6600份药用植物样本的psbA-trnH、matK、rbcL、rpoC1、ycf5、ITS2及ITS等 7個序列，进行DNA条形码序列筛选，首次提出了ITS2作为药用植物DNA条形码的候选序列;张嘉丽等[15]对真菌类药材马勃（Lasiosphaeracalvatia）及其混伪品的DNA条形码研究表明，基于ITS序列的条形码技术可以将马勃药材及其混伪品有效进行鉴别;Tripathi等[16]通过对印度热带树种的DNA条形码筛选研究表明，ITS序列对热带树种的鉴定成功率为24.4%～74.3%;Fladung等[17]对墨西哥桉属（Eucalyptus）植物的DNA条形码研究表明，ITS序列较叶绿体序列能更好的鉴定桉属植物。为了把DNA条形码技术更好的利用在木本植物分类及鉴定中，本文基于ITS序列对贵州省30种林木树种进行分类鉴定，30种林木树种材料的选取为贵州地区社会价值较高或濒危物种，旨在为林木树种的鉴定及濒危树种的保护提供分子理论基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
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1.2 DNA提取、扩增及测序
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2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果及序列分析
部分林木树种PCR扩增电泳，PCR产物条带清晰，扩增成功率较好，产物符合ITS序列长度（600～800 bp）。用MEGA 5.0软件对序列分析表明，30种林木树种ITS序列总长度为506～684 bp，有593个变异位点，555个信息位点，包括碱基之间的转换和颠换，碱基转换与颠换比为1.11，其中平均G+C含量为64%，由此可见，30种林木树种碱基的变异较大。
2.2 种内及种间遗传距离分析
用MEGA 5.0软件采用K2P模型对30种林木树种的种内及种间的遗传距离分析，结果表明，种内平均遗传距离为0.013，其中垂柳的种内遗传距离最大（0.199）;种间平均遗传距离为0.236，其中马缨杜鹃与露珠杜鹃及大白杜鹃、露珠杜鹃与大白杜鹃、华中樱与樱桃之间的遗传距离均为0，垂柳与女贞之间的遗传距离最大（0.51）。由此可见，ITS序列在种内的遗传距离都较小，种间的遗传距离均较大，满足理想DNA条形码的要求。 2.3 序列的barcoding gap评估
通过对ITS序列遗传距离的Barcoding Gap图可以看出，nrITS序列的Barcoding Gap位置在0.1～0.2之間，种内遗传距离大部分集中在0.02以下区域，而种间遗传距离多集中于0.2～0.4之间，种内遗传距离与种间遗传距离存在部分重叠现象，但重叠部分中，两者所占的比例都不高，由此可见，种内与种间的遗传距离频率分布差异明显，满足理想的DNA条形码中种内遗传距离小、种间遗传距离大等特点。
2.4 系统聚类分析
基于nrITS序列对30种林木树种的聚类分析结果表明，不同种的林木植物总体上能较好的区分开，且同一种林木树种的三个平行都能较好的聚为一支，且自展支持率均高于70%，但杜鹃属中的马缨杜鹃、大白杜鹃、羊踟蹰以及露珠杜鹃中的部分种混合聚合3支，樱属中的华中樱桃和樱桃共同聚为一支，不能较好的分开，表明基于ITS对30种林木树种的鉴定成功率为83%。
3 结论与讨论
DNA条形码技术（DNA barcoding）是用短的DNA片段对物种进行识别和鉴定的分子生物学技术[20]，该技术作为一种分子诊断已被普遍应用到物种鉴定[21-22]，其结果客观性强且操作较简便，大大提高了非专业人员进行物种鉴定的效率和准确性，成为分类学家非常有力的工具[23]。理想的条形码基因片段应该满足以下几个特点：（1）种间变异明显大于种内变异;（2）一个或少数基因片段即可准确鉴定物种;（3）重复性好;（4）稳定性高;（5）操作简便，可实现自动化;（6）有统一的管理平台等[24-25]。本研究结果表明，核糖体ITS序列扩增及测序成功率都高，序列在Genbank中Blast比对时对物种的鉴定成功率较好，且NJ法构建的系统发育树能区分大部分物种，满足理想的DNA条形码要求，故推荐ITS序列作为林木树种的DNA条形码候选序列之一。
就遗传距离而言，本研究中的30种物种的种内遗传距离均很小，种间的遗传距离总体上都很大，表明ITS在林木树种植物的进化速率符合种内进化小、种间进化大的要求。从系统发育进化树来看，在杜鹃属的5种植物中，仅有百合花杜鹃能独立聚为一支，而其他4种杜鹃植物共同聚为3支，且种间平行样本出现交叉现象;同时在蔷薇科（Rosaceae）樱属（Cerasus）的华中樱（Cerasusconradinae）和樱桃（Cerasuspseudocerasus）两种植物共同聚为一支，不能区分开，存在的原因可能与物种的鉴定及nrITS基因在该种植物中进化速率存在一定的关系[26]。同时在30种林木树种中同一科的不同植物聚为一支，如木犀科（Oleaceae）的女贞（Ligustrumlucidum）和木犀（Osmanthusfragrans），蔷薇科（Rosaceae）中的杏（Armeniaca vulgaris）、枇杷（Eriobotrya japonica）及桃（Amygdaluspersica），槭树科（Aceraceae）的三角槭（Acer buergerisnum）和贵州槭（Acer guizhoueuse）都分别聚为一支，支持率均大于90%，表明ITS 序列对属级以上的林木树种具有较高的分辨率，且对物种的系统发育具有一定的参考价值。
参 考 文 献：
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[8] Iftikhar R，Ashfaq M，Rasool A，et al.DNA Barcode Analysis of Thrips （Thysanoptera） Diversity in Pakistan Reveals Cryptic Species Complexes[J].PLos One，2016，11（1），e0146014. [9] Chen S L，Yao H，Han J P，et al.Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J].PLoS One，2010（5）：e8613.
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[12] Lahaye R，Vand B M，Bogarin D，Warner J，et al.DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2008，105（8）：2923-2928.
[13] Taberlet P，Coissac E，Pompanon F，et al.Power and limitations of the chloroplast trnL （UAA） intron for plant DNA barcoding[J].Nucleic Acids Research，2007，35（3）：e14.
[14] Pettengill J B，Neel M C.An evaluation of candidate plant DNA barcodes and assignment methods in diagnosing 29 species in the genus Agalinis （Orobanchaceae）[J]. American Journal of Botany，2010，97（8）：1391-1406.
[15] 張嘉丽，黄宇航，宋 明，等.基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品[J].世界中医药，2016，11（5）：777-780+785.
[16] Abhinandan M T，Antariksh T，Anoop K，et al.The internal transcribed spacer （ITS） region and trnhH-psbA are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India[J].PLos One，2013，8（2）：e57934-e57934.
[17] Fladung M，Schoeder H，Wehenkel C，et al.Differentiation of six Eucalyptus trees grown in Mexico by ITS and six chloroplast barcoding markers[J].Silvae Genetica，2015，64（3）：121-130.
[18] Doyle J.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemical Bulletin，1987（19）：11-15.
[19] Wendel J F，Schnabel A，Seelanan T.Bidirectional interlocus concerted evolution following allopolyploid speciation in cotton[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1995（1）：280-284.
[20] 闫化学，于 杰.DNA条形码技术在植物中的研究现状[J].植物学报，2010，45（1）：102-108.
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