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摘要：植物蛋白质在现代人类生活中发挥着日益重要的作用，其分离纯化已成为蛋白质研究的重要课题之一。本文在概述了植物蛋白质预处理方法的基础上，对植物蛋白质分离纯化技术如膜分离技术、离心分离技术、凝胶层析技术、盐析法、等电沉淀法、电泳、离子交换层析、等进行了综述，并对植物蛋白分离纯化的发展进行了展望。
关键词：植物蛋白质；提取；分离纯化
Abstract： Plant protein plays an increasingly important role in modern life， and the isolation and purification of target protein from plant has become one of the hot topics in protein research. In this paper， based on introducing pretreatment methods of plant samples， the protein isolation techniques such as membrane separation， centrifugation， gel chromatography， salting out， isoelectric precipitation， electrophoresis， ion exchange chromatography， are reviewed， and the development or the protein purification plant is prospected.
Key words： plant protein； extraction； isolation and purification
蛋白質是生命活动的物质承担者，存在于所有生物中。蛋白质参与生物形态结构的建成，基因表达的调节，生物信息传递，生物分子催化、代谢以及学习、防御等多种生命活动过程。近年来一些研究表明植物蛋白相对动物蛋白在生物发育过程中和在人体健康中发挥着不可比拟的作用。蛋白质在人类日常生活中的越发重要，但由于动物蛋白生产周期长且价格昂贵，通过发展植物蛋白作为人类日常蛋白摄入的主要来源成为一条切实可行的道路，所以植物蛋白质的分离与纯化已成为当前生物研究的关键问题。
根据蛋白质的理化性质，本文综述了目前国内外关于植物蛋白质提取和分离纯化技术。
1、植物蛋白质分离纯化的预处理
植物蛋白质的分离纯化，首先要将其从原来组织中释放出来，并且要保证其活性不会丧失、天然状态不被改变。但由于蛋白质氨基酸种类繁多，使得其表现出不同的理化性质。因此，蛋白质的提取要根据蛋白质不同的特性选取不同的方法。目前，已报道的关于植物蛋白的提取方法主要分为机械法和非机械法两大类。机械法珠磨法、压榨法、高压匀浆和超声波破碎法。非机械法包括反复冻融法、有机溶剂提取法、酶法、碱溶酸沉法等。以上植物蛋白质预处理方法都是为了将植物组织细胞中的蛋白质一次形式放出来，但都是为后期的蛋白质分离纯化做准备，所以在蛋白质的预处理中可将几种方法混合使用，以便获取更高浓度的蛋白质。
2、植物蛋白质的分离纯化
2.1根据蛋白质分子大小不同进行分离纯化
2.1.1膜分离技术
膜分离技术是指在外力或化学位差作用下，是两组或者多组液体混合物通过特定膜的渗透作用得以分离、分级、提纯、富集的过程。根据膜的性质及外力的不同，膜分离技术可分为微滤、超滤、纳滤、电渗析、液膜、反渗透与渗透。这些方法都可以将大分子的蛋白质与大多小分子无机盐分离。膜分离技术常和其他技术联合使用，Tsuru等通过纳滤技术与调节PH 值对多态和氨基酸混合体系进行分离[1]。
2.1.2离心分离技术
在离心作用下也可实现蛋白质的分离，差速离心包括了速率区带离心和差速离心法。速率区带离心法指根据颗粒在介质中的沉降速度不同来分离试样的方法。 它需要在离心管装入密度梯度介质如蔗糖、甘油、CSCL等，然后再加入蛋白质溶液进行离心，这样蛋白质会处于密度相似的区带中，从而达到蛋白质分离的效果。差速离心法通过不断增加相对离心力，使沉降速度不同蛋白质在不同离心力作用下分部沉淀。孙富等将以上两种方法与有机溶剂沉淀法结合使用提取出了甘蔗叶绿体蛋白[2]。
2.1.3凝胶层析技术
凝胶过滤层析法主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。用一定大小孔隙的交联聚合物（如葡萄糖、琼脂糖等）作层析介质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。大的蛋白质不能进入介质，直接很快的通过层析柱；而较小的蛋白质可以进入介质，所以通过路程变长，通过速度与其大小相关。这种技术可以分离蛋白质量范围0.1–100 kDa，取决于孔隙的大小。Fujita等通过疏水层析、离子交换层析及Sephadex G-50凝胶过滤结合的方法从蔬菜奶酪纳豆分离纯化纳豆激酶[3]。
2.1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE是以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳。大约每一个SDS分子与两个氨基酸结合，這掩盖了蛋白质的天然电荷，产生的净负电荷与蛋白质的质量成正比。在电泳过程中，凝胶起分子筛的作用，因此样品中蛋白质的迁移率与其质量成反比（高分子量蛋白质比较小的蛋白质更容易被阻滞）。由Laemmli提出的原始设置不适合于低分子量（<10 kDa）蛋白分离，但后面研究中的修改克服了这个限制。
2.2根据溶解度的不同进行分离纯化
2.2.1盐析法
盐析是植物蛋白提取的机制是高浓度的盐溶液中的异性离子可中和蛋白质颗粒的表面电荷，从而破坏蛋白质分子表面的水化层，使其稳定性改变，降低了溶解度，从水溶液中沉淀出来。 2.2.2等电点沉淀法和PH值调节法
不同蛋白质有不同的等电点，利用蛋白质在等电点处溶解度最低的原理，将溶液的PH值调节到PI处，此时蛋白质溶解度降低，从而形成沉淀从溶液中分离出来。
2.3根据电荷不同进行分离纯化
2.3.1电泳
带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。包括了等电聚焦电泳、双向凝胶电泳、毛细管电泳等。等电聚焦电泳利用两性电解质为缓冲液，电泳时形成一个从正极到负极pH逐渐增加的梯度介质。在电场内经过一定时间后，各蛋白质组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区。双向凝胶电泳在1975年引入，原理是第一维度基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二维度则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。Wang， Scali用双向电泳法分离纯化了富含干扰化合物的橄榄叶植物组织的蛋白质[4]。
2.3.2离子交换层析
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，随后提高洗脱液中盐酸的浓度将其依次洗脱下来。Svensson等通过热分离、固定化金屬离子亲和层析、离子交换层析等三步纯化方案，成功地纯化到浓度95%以上拟南芥重组蛋白。
2.4色谱分离技术分离纯化蛋白
色譜分离技术是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同蛋白质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数来进行分离的。当两相作相对运动时，蛋白质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。色谱分离法包括可分为高效液相色谱、吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、亲和色谱、大孔吸附树脂、凝胶色谱、聚焦色谱等。Peter 等用高效液相色谱分离出了含丰富硒氨基酸绿色豌豆蛋白，研究了其对人类和动物的营养价值。
3.展望
随着科学技术的不断发展，植物蛋白的提取分离纯化技术也得到了很大程度上的发展。但是，到目前为止，还没有一种方法能够植物中的某一特定蛋白完全纯化分离出来。大多都要将几种分离纯化技术结合，才能得到产品纯度较高的蛋白质，希望研究工作者能够探索一种更好的提纯植物蛋白质的方法，使得对植物蛋白质的研究有更进一步的发展。随着植物蛋白质在人类生活中发挥着日益重要的作用，植物蛋白的分离纯化对生物学的研究和人类的营养需求有着至关重要的作用，因此推动动植物蛋白分离纯化技术的发展具有重要意义，能够使人类对植物蛋白的研究进入一个新的时代。
参考文献
[1]Tsuru T， Shutou T， Nakaos， et al.Peptide and amino acid separation by nanofiltration membranes[J].Sep Sci Technol，1994，29：971-984.
[2]孙富，黄巧玲，黄杏，张保青，陈明辉，杨丽涛，李杨瑞. 甘蔗叶绿体分离及其蛋白质提取方法研究[J]. 南方农业学报，2011，05：463-467.
[3] Fujita M.， Nomura K.， Hong K.， et al. Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto， a popular soybean fermented food in Japan[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications.1993，197：1340-1347.
[4] Wei Wang， Monica Scali， Rita Vignani， et al. Protein extraction for two-dimensional electrophoresis from olive leaf， a plant tissue containing high levels of interfering compound[J]. Electrophoresis ，2003， 24：2369-2375.
关键词：植物蛋白质；提取；分离纯化
Abstract： Plant protein plays an increasingly important role in modern life， and the isolation and purification of target protein from plant has become one of the hot topics in protein research. In this paper， based on introducing pretreatment methods of plant samples， the protein isolation techniques such as membrane separation， centrifugation， gel chromatography， salting out， isoelectric precipitation， electrophoresis， ion exchange chromatography， are reviewed， and the development or the protein purification plant is prospected.
Key words： plant protein； extraction； isolation and purification
蛋白質是生命活动的物质承担者，存在于所有生物中。蛋白质参与生物形态结构的建成，基因表达的调节，生物信息传递，生物分子催化、代谢以及学习、防御等多种生命活动过程。近年来一些研究表明植物蛋白相对动物蛋白在生物发育过程中和在人体健康中发挥着不可比拟的作用。蛋白质在人类日常生活中的越发重要，但由于动物蛋白生产周期长且价格昂贵，通过发展植物蛋白作为人类日常蛋白摄入的主要来源成为一条切实可行的道路，所以植物蛋白质的分离与纯化已成为当前生物研究的关键问题。
根据蛋白质的理化性质，本文综述了目前国内外关于植物蛋白质提取和分离纯化技术。
1、植物蛋白质分离纯化的预处理
植物蛋白质的分离纯化，首先要将其从原来组织中释放出来，并且要保证其活性不会丧失、天然状态不被改变。但由于蛋白质氨基酸种类繁多，使得其表现出不同的理化性质。因此，蛋白质的提取要根据蛋白质不同的特性选取不同的方法。目前，已报道的关于植物蛋白的提取方法主要分为机械法和非机械法两大类。机械法珠磨法、压榨法、高压匀浆和超声波破碎法。非机械法包括反复冻融法、有机溶剂提取法、酶法、碱溶酸沉法等。以上植物蛋白质预处理方法都是为了将植物组织细胞中的蛋白质一次形式放出来，但都是为后期的蛋白质分离纯化做准备，所以在蛋白质的预处理中可将几种方法混合使用，以便获取更高浓度的蛋白质。
2、植物蛋白质的分离纯化
2.1根据蛋白质分子大小不同进行分离纯化
2.1.1膜分离技术
膜分离技术是指在外力或化学位差作用下，是两组或者多组液体混合物通过特定膜的渗透作用得以分离、分级、提纯、富集的过程。根据膜的性质及外力的不同，膜分离技术可分为微滤、超滤、纳滤、电渗析、液膜、反渗透与渗透。这些方法都可以将大分子的蛋白质与大多小分子无机盐分离。膜分离技术常和其他技术联合使用，Tsuru等通过纳滤技术与调节PH 值对多态和氨基酸混合体系进行分离[1]。
2.1.2离心分离技术
在离心作用下也可实现蛋白质的分离，差速离心包括了速率区带离心和差速离心法。速率区带离心法指根据颗粒在介质中的沉降速度不同来分离试样的方法。 它需要在离心管装入密度梯度介质如蔗糖、甘油、CSCL等，然后再加入蛋白质溶液进行离心，这样蛋白质会处于密度相似的区带中，从而达到蛋白质分离的效果。差速离心法通过不断增加相对离心力，使沉降速度不同蛋白质在不同离心力作用下分部沉淀。孙富等将以上两种方法与有机溶剂沉淀法结合使用提取出了甘蔗叶绿体蛋白[2]。
2.1.3凝胶层析技术
凝胶过滤层析法主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。用一定大小孔隙的交联聚合物（如葡萄糖、琼脂糖等）作层析介质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。大的蛋白质不能进入介质，直接很快的通过层析柱；而较小的蛋白质可以进入介质，所以通过路程变长，通过速度与其大小相关。这种技术可以分离蛋白质量范围0.1–100 kDa，取决于孔隙的大小。Fujita等通过疏水层析、离子交换层析及Sephadex G-50凝胶过滤结合的方法从蔬菜奶酪纳豆分离纯化纳豆激酶[3]。
2.1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE是以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳。大约每一个SDS分子与两个氨基酸结合，這掩盖了蛋白质的天然电荷，产生的净负电荷与蛋白质的质量成正比。在电泳过程中，凝胶起分子筛的作用，因此样品中蛋白质的迁移率与其质量成反比（高分子量蛋白质比较小的蛋白质更容易被阻滞）。由Laemmli提出的原始设置不适合于低分子量（<10 kDa）蛋白分离，但后面研究中的修改克服了这个限制。
2.2根据溶解度的不同进行分离纯化
2.2.1盐析法
盐析是植物蛋白提取的机制是高浓度的盐溶液中的异性离子可中和蛋白质颗粒的表面电荷，从而破坏蛋白质分子表面的水化层，使其稳定性改变，降低了溶解度，从水溶液中沉淀出来。 2.2.2等电点沉淀法和PH值调节法
不同蛋白质有不同的等电点，利用蛋白质在等电点处溶解度最低的原理，将溶液的PH值调节到PI处，此时蛋白质溶解度降低，从而形成沉淀从溶液中分离出来。
2.3根据电荷不同进行分离纯化
2.3.1电泳
带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。包括了等电聚焦电泳、双向凝胶电泳、毛细管电泳等。等电聚焦电泳利用两性电解质为缓冲液，电泳时形成一个从正极到负极pH逐渐增加的梯度介质。在电场内经过一定时间后，各蛋白质组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区。双向凝胶电泳在1975年引入，原理是第一维度基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二维度则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。Wang， Scali用双向电泳法分离纯化了富含干扰化合物的橄榄叶植物组织的蛋白质[4]。
2.3.2离子交换层析
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，随后提高洗脱液中盐酸的浓度将其依次洗脱下来。Svensson等通过热分离、固定化金屬离子亲和层析、离子交换层析等三步纯化方案，成功地纯化到浓度95%以上拟南芥重组蛋白。
2.4色谱分离技术分离纯化蛋白
色譜分离技术是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同蛋白质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数来进行分离的。当两相作相对运动时，蛋白质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。色谱分离法包括可分为高效液相色谱、吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、亲和色谱、大孔吸附树脂、凝胶色谱、聚焦色谱等。Peter 等用高效液相色谱分离出了含丰富硒氨基酸绿色豌豆蛋白，研究了其对人类和动物的营养价值。
3.展望
随着科学技术的不断发展，植物蛋白的提取分离纯化技术也得到了很大程度上的发展。但是，到目前为止，还没有一种方法能够植物中的某一特定蛋白完全纯化分离出来。大多都要将几种分离纯化技术结合，才能得到产品纯度较高的蛋白质，希望研究工作者能够探索一种更好的提纯植物蛋白质的方法，使得对植物蛋白质的研究有更进一步的发展。随着植物蛋白质在人类生活中发挥着日益重要的作用，植物蛋白的分离纯化对生物学的研究和人类的营养需求有着至关重要的作用，因此推动动植物蛋白分离纯化技术的发展具有重要意义，能够使人类对植物蛋白的研究进入一个新的时代。
参考文献
[1]Tsuru T， Shutou T， Nakaos， et al.Peptide and amino acid separation by nanofiltration membranes[J].Sep Sci Technol，1994，29：971-984.
[2]孙富，黄巧玲，黄杏，张保青，陈明辉，杨丽涛，李杨瑞. 甘蔗叶绿体分离及其蛋白质提取方法研究[J]. 南方农业学报，2011，05：463-467.
[3] Fujita M.， Nomura K.， Hong K.， et al. Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto， a popular soybean fermented food in Japan[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications.1993，197：1340-1347.
[4] Wei Wang， Monica Scali， Rita Vignani， et al. Protein extraction for two-dimensional electrophoresis from olive leaf， a plant tissue containing high levels of interfering compound[J]. Electrophoresis ，2003， 24：2369-2375.