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摘要[目的]分析生物土壤结皮土生对齿藓转录组SSR位点。[方法]以生物土壤结皮土生对齿藓为材料，分析土生对齿藓转录组数据，开发土生对齿藓SSR分子标记技术。[结果]通过MISA软件对土生对齿藓高通量测序获得的73084条unigenes进行SSR筛选。从搜索序列中发现4103个符合条件的SSRs，分布在3420条unigenes上，出现频率为5.62%。三核苷酸和二核苷酸为主要重复类型，分别占SSR总数的47.9%和26.1%，AGC/CTG（31.9%）和AG/CT（75.5%）分别是其主要重复基元。69.0%的基序长度为12～20bp。[结论]土生对齿藓转录组SSR位点出现频率高、类型丰富、多态性潜能大，为土生对齿藓分子生物学机制研究等方面提供理论依据。
关键词 土生对齿藓；转录组；SSR
中图分类号 S188 文献标识码A 文章编号0517-6611（2018）11-13078-03
土生对齿藓（Didymodonvinealis）属于土壤结皮藓类植物，广泛存在于干旱、半干旱地区，对于维持生物土壤结皮的稳定，抵御风蚀、水蚀起着关键作用。人们对生物土壤结皮中苔藓的干旱适应性形态特征和繁殖特性已有相关研究。
简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR）又称微卫星DNA（microsatdliteDNA），是由1～6个核苷酸串联重复单元组成，长度为10～100bp。SSR具有分布广泛、多态性强、数量丰富和共显性遗传易于分析等特点，可作为较为理想的遗传标记。SSR标记已被广泛应用于水稻、大麦、小麦、玉米等植物的遗传图谱构建、遗传多态性分析、品种鉴定、分子标记辅助育种等研究。
随着新一代高通量测序技术的成熟，转录组学得到快速发展，除小立碗藓之外，对藓类植物转录组学的测定鲜有报道。笔者通过高通量测序方法，从分子水平对土生对齿藓的SSR进行多态性研究，为进一步探索土生对齿藓分子生物学机制提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料 供试样品生物土壤结皮土生对齿藓采集自腾格里沙漠东南缘宁夏中卫市沙坡头地区。沙坡头地区属草原化荒漠地带，气候干旱而多风，土壤基质为松散的流沙，沙层稳定含水量仅2%～3%。
1.2提取ToralRNA 称取样品0.03g放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，加入提取液振荡混匀，具体操作参考RNApreppure植物总RNA提取试剂盒说明书。利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量1μg，浓度≥50ng/μL，OD260/OD280介于1.8～2.2。
1.3RNA-seq测序流程利用带有Oligo（dT）的磁珠与ployA进行A-T碱基配对，可以从总RNA中分离出mR-NA，用于分析转录组信息。反转合成cDNA在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，随后进行二链合成，形成稳定的双链结构。连接ada-ptor双链的cDNA结构为黏性末端，加入EndRepairMix将其补成平末端，随后在3’末端加上1个A碱基，用于連接Y字形的接头，最后进行IlluminaHiseq上机测序。
1.4土生对齿藓转录组SSR的筛选 采用MISA1.0软件（hnp：//pgre.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）对组装后获得的unigenes进行SSR检测，参数为单核苷酸至少重复10次；二核苷酸至少重复6次；三至六核苷酸至少重复5次。
2结果与分析
2.1土生对齿藓转录组SSR位点数量与分布频率 由表1可知，利用MIsA软件搜索土生对齿藓转录组中的73084条unigenes序列，共在3420条unigenes中找到4103个符合条件的SSR8，SSR发生频率（包含SSR的unigenes数与总uni-genes数之比）为4.68%。545条unigenes含有1个以上SSR位点，227条unigenes含有复合SSRs。土生对齿藓转录组中SSR的出现频率（SSR数与总unigenes数之比）为5.62%。土生对齿藓转录组SsR种类较为丰富，从重复次数看，发现重复基元以重复5次出现的频率最高，占总SSR的29.6%；其次为6、10、7次重复，分别占总SSR的24.6%、12.9%和12.4%；而重复11次以上的基序，占比仅7.4%（表2）。
从核苷酸的基序类型来看，土生对齿藓转录组SSR以三核苷酸重复基序为主要类型，占总SSR的47.9%；其次是二核苷酸、单核苷酸重复基序，出现频率分别为26.1%和23.1%。单核苷酸重复基元以A/T占比达92.6%；二核苷酸重复类型中，以AG/CT重复基元为主，占比可达75.5%；三核苷酸重复类型中，AGC/CTG重复基元所占比例最多，达31.9%，其次是AGG/CCT和AAG/CTT，所占比例分别为14.4%和12.5%。四、五、六核苷酸重复类型中，重复基序出现次数普遍偏低（表3）。
2.2土生对齿藓转录组SSR的可用性评价 依据SSR标记多态性可判断其使用性能，SSR多态性受其长度影响很大。通常，当SSR长度小于12bp时，多态性很低；当长度为12～20bp时，多态性中等；而当多态性大于或者等于20bp时多态性较高。该研究中，土生对齿藓转录组SSR长度小于12bp的有609个，占总数的15.7%；长度为12～20bp的SSR最多，达2674个，占总数的69.0%；长度为20bp以上的SSR总计593个，占总数的15.3%。可见土生对齿藓转录组检测到的SSR位点具有较高的多态性（图1）。
3讨论
土生对齿藓是土壤结皮植物的重要组成部分，该研究基于高通量测序拼接后得到unigenes，首次对土生对齿藓转录组进行SSR位点信息搜索与分析。在得到的73084条unl-genes中进行SSR搜索，共在3420条unigenes中找到了4103个符合条件的SSRs，SSR的出现频率为5.62%。通过与蕨类及藻类植物比较发现，土生对齿藓的出现频率要比蕨类植物芒萁（Dicranopterispedata，21.03%）、鸟巢蕨（Neottopterisnidus，14.14%）、紫萁（Osmundajaponica，21.73%）、姬蕨（Hypolepisputtee，19.37%）低，但是比藻类植物大叶藻（ZosteramarinaL.，1.7%）、条斑紫菜（Porphyrayezoensis，1.53%）高。因此推测，SSR出现频率具有种属特异性。
很多植物的SSR都以三核苷酸和二核苷酸为主，但主要的重复基元不同。在该研究中，土生对齿藓SSR中三核苷酸为主要重复类型，出现频率最高，占总SSR的47.9%，二核苷酸重复类型中以AG/CT为主要重复基元。值得注意的是蕨类植物鸟巢蕨、紫萁、姬蕨的主要重复类型都是二核苷酸，且重复基元都为AG/CT，可推测AG/CT在SSR标记中扮演着十分重要的角色。
该研究结果表明，土生对齿藓转录组SSR数量多、种类较为丰富，并具有较高的多态性。土生对齿藓转录组SSR对于今后土生对齿藓功能基因资源的开发利用、遗传资源评价、丰富其分子标记、种质资源开发和比较基因组学研究都具有重要的价值。
关键词 土生对齿藓；转录组；SSR
中图分类号 S188 文献标识码A 文章编号0517-6611（2018）11-13078-03
土生对齿藓（Didymodonvinealis）属于土壤结皮藓类植物，广泛存在于干旱、半干旱地区，对于维持生物土壤结皮的稳定，抵御风蚀、水蚀起着关键作用。人们对生物土壤结皮中苔藓的干旱适应性形态特征和繁殖特性已有相关研究。
简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR）又称微卫星DNA（microsatdliteDNA），是由1～6个核苷酸串联重复单元组成，长度为10～100bp。SSR具有分布广泛、多态性强、数量丰富和共显性遗传易于分析等特点，可作为较为理想的遗传标记。SSR标记已被广泛应用于水稻、大麦、小麦、玉米等植物的遗传图谱构建、遗传多态性分析、品种鉴定、分子标记辅助育种等研究。
随着新一代高通量测序技术的成熟，转录组学得到快速发展，除小立碗藓之外，对藓类植物转录组学的测定鲜有报道。笔者通过高通量测序方法，从分子水平对土生对齿藓的SSR进行多态性研究，为进一步探索土生对齿藓分子生物学机制提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料 供试样品生物土壤结皮土生对齿藓采集自腾格里沙漠东南缘宁夏中卫市沙坡头地区。沙坡头地区属草原化荒漠地带，气候干旱而多风，土壤基质为松散的流沙，沙层稳定含水量仅2%～3%。
1.2提取ToralRNA 称取样品0.03g放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，加入提取液振荡混匀，具体操作参考RNApreppure植物总RNA提取试剂盒说明书。利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量1μg，浓度≥50ng/μL，OD260/OD280介于1.8～2.2。
1.3RNA-seq测序流程利用带有Oligo（dT）的磁珠与ployA进行A-T碱基配对，可以从总RNA中分离出mR-NA，用于分析转录组信息。反转合成cDNA在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，随后进行二链合成，形成稳定的双链结构。连接ada-ptor双链的cDNA结构为黏性末端，加入EndRepairMix将其补成平末端，随后在3’末端加上1个A碱基，用于連接Y字形的接头，最后进行IlluminaHiseq上机测序。
1.4土生对齿藓转录组SSR的筛选 采用MISA1.0软件（hnp：//pgre.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）对组装后获得的unigenes进行SSR检测，参数为单核苷酸至少重复10次；二核苷酸至少重复6次；三至六核苷酸至少重复5次。
2结果与分析
2.1土生对齿藓转录组SSR位点数量与分布频率 由表1可知，利用MIsA软件搜索土生对齿藓转录组中的73084条unigenes序列，共在3420条unigenes中找到4103个符合条件的SSR8，SSR发生频率（包含SSR的unigenes数与总uni-genes数之比）为4.68%。545条unigenes含有1个以上SSR位点，227条unigenes含有复合SSRs。土生对齿藓转录组中SSR的出现频率（SSR数与总unigenes数之比）为5.62%。土生对齿藓转录组SsR种类较为丰富，从重复次数看，发现重复基元以重复5次出现的频率最高，占总SSR的29.6%；其次为6、10、7次重复，分别占总SSR的24.6%、12.9%和12.4%；而重复11次以上的基序，占比仅7.4%（表2）。
从核苷酸的基序类型来看，土生对齿藓转录组SSR以三核苷酸重复基序为主要类型，占总SSR的47.9%；其次是二核苷酸、单核苷酸重复基序，出现频率分别为26.1%和23.1%。单核苷酸重复基元以A/T占比达92.6%；二核苷酸重复类型中，以AG/CT重复基元为主，占比可达75.5%；三核苷酸重复类型中，AGC/CTG重复基元所占比例最多，达31.9%，其次是AGG/CCT和AAG/CTT，所占比例分别为14.4%和12.5%。四、五、六核苷酸重复类型中，重复基序出现次数普遍偏低（表3）。
2.2土生对齿藓转录组SSR的可用性评价 依据SSR标记多态性可判断其使用性能，SSR多态性受其长度影响很大。通常，当SSR长度小于12bp时，多态性很低；当长度为12～20bp时，多态性中等；而当多态性大于或者等于20bp时多态性较高。该研究中，土生对齿藓转录组SSR长度小于12bp的有609个，占总数的15.7%；长度为12～20bp的SSR最多，达2674个，占总数的69.0%；长度为20bp以上的SSR总计593个，占总数的15.3%。可见土生对齿藓转录组检测到的SSR位点具有较高的多态性（图1）。
3讨论
土生对齿藓是土壤结皮植物的重要组成部分，该研究基于高通量测序拼接后得到unigenes，首次对土生对齿藓转录组进行SSR位点信息搜索与分析。在得到的73084条unl-genes中进行SSR搜索，共在3420条unigenes中找到了4103个符合条件的SSRs，SSR的出现频率为5.62%。通过与蕨类及藻类植物比较发现，土生对齿藓的出现频率要比蕨类植物芒萁（Dicranopterispedata，21.03%）、鸟巢蕨（Neottopterisnidus，14.14%）、紫萁（Osmundajaponica，21.73%）、姬蕨（Hypolepisputtee，19.37%）低，但是比藻类植物大叶藻（ZosteramarinaL.，1.7%）、条斑紫菜（Porphyrayezoensis，1.53%）高。因此推测，SSR出现频率具有种属特异性。
很多植物的SSR都以三核苷酸和二核苷酸为主，但主要的重复基元不同。在该研究中，土生对齿藓SSR中三核苷酸为主要重复类型，出现频率最高，占总SSR的47.9%，二核苷酸重复类型中以AG/CT为主要重复基元。值得注意的是蕨类植物鸟巢蕨、紫萁、姬蕨的主要重复类型都是二核苷酸，且重复基元都为AG/CT，可推测AG/CT在SSR标记中扮演着十分重要的角色。
该研究结果表明，土生对齿藓转录组SSR数量多、种类较为丰富，并具有较高的多态性。土生对齿藓转录组SSR对于今后土生对齿藓功能基因资源的开发利用、遗传资源评价、丰富其分子标记、种质资源开发和比较基因组学研究都具有重要的价值。