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摘 要：建立HPLC法测定富马酸福莫特罗的有关物质。所有验证结果均符合中国药典 2010 年版二部附录 XIX A 药品质量标准分析方法验证指导原则的相关要求。
关键词：高效液相色谱法；富马酸福莫特罗；有关物质
富马酸福莫特罗是一种长效β2——受体激动剂，具有长效，高选择性，副作用小的显著特点，临床上广泛用于哮喘。本实验参照USP37的色谱条件，建立HPLC测定富马酸福莫特罗有关物质的方法。
1 仪器和试药
美国Waters e2695高效液相色谱仪：2489紫外检测器，A10707051Z四元泵，A105CH251G柱温箱，Empower 3色谱工作站，KQ5200B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）.富马酸福莫特罗工作对照品：自制（滴定纯度99.9%），杂质G、A、C、E对照品由上海医药工业研究院提供。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为制药用注射用水。
2 方法和结果
2.1色谱条件与系统适应性试验 色谱柱：采用 Agilent，ZORBAX SB-C8 column（150 mm × 4.6 mm，5 um）， 称取4.212g二水磷酸二氢钠，加水1000ml溶解并混匀（加磷酸调节PH为3.1±0.1）为流动相A，乙腈为流动相B，流速1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温：25℃，进样量：20ul，理论塔板数按福莫特罗峰计算不低于2000。
2.2稀释剂溶液的配制 稀释剂：含0.037mol/L磷酸二氢钠和0.005mol/L磷酸氢二钠的水溶液，pH为6.0±0.1）-乙腈（84：16）
2.3 空白干扰试验 取制药用注射用水为空白溶液，精密进样20ul，记录色谱图。
2.4 系统适应性溶液的配制 称取富马酸福莫特罗对照品和富马酸福莫特罗杂质C对照品适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含富马酸福莫特罗200μg以及富马酸福莫特罗杂质C0.4μg的系统适用性溶液，量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.5 样品溶液的配制 富马酸福莫特罗样品20mg，精密称定，置100mL量瓶中，加稀释剂约50mL，超声溶解。放冷至室温，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，配成0.2mg/mL的样品溶液。
2.6 专属性试验 考察空白溶剂或其他有关物质存在情况下，样品中有关物质的测定是否受到干扰。
2.6.1空白溶剂、富马酸福莫特罗系统适用性溶液、样品溶液均按照方法描述配制。在方法规定的色谱条件下进样，并记录色谱图。
2.6.2 空白溶剂在富马酸福莫特罗及其各有关物质出峰处没有干扰。各峰与各待测杂质之间，各峰与主峰之间的分离度均大于 1.5，且主峰与杂质 C 的分离度大于 1.5，各待测杂质之间的分离度也同样大于1.5。
2.7 线性范围试验
2.7.1制备富马酸福莫特罗及杂质 G、A、C、E 对照品配制成0.2mg/mL的储备溶液。精密移取富马酸福莫特罗储备溶液、杂质 E 对照品储备溶液、杂质 G 对照品储备溶液各 1ml、杂质 C 对照品储备溶液2ml、杂质 A 对照品储备溶液3mL，稀释 500 倍制成线性测试对照品混合储备溶液。
2.7.2 结果：富马酸福莫特罗峰面积对浓度的线性回归方程为 y = 86.573x - 0.1523，线性相关系数 r= 0.999，Y 轴截距值小于定量限响应值的±50%；
结果显示该方法在各限度浓度的 QL～150%的浓度范围内响应值与浓度呈现良好线性，线性范围满足要求。
2.8准确度试验
2.8.1按照规定的方法制备样品溶液；制备杂质限度水平的 50%、100%和 150%水平的杂质储备溶液，每个水平平行制备三份，并用上述杂质储备溶液作为溶剂，制备成杂质浓度分别为限度水平的 50%、100%和 150%水平的九份样品溶液。在方法规定的色谱条件进样 。
2.8.2 在富马酸福莫特罗原料药杂质限度水平的 50%、100%、150%三个浓度下，分别计算各有关物质的回收率，考察方法的准确度，回收率结果显示：杂质 G 在 9 份样品的回收率均在 80.0%～120.0% 范围内，平均回收率为 110.1%， RSD 为 1.2%。
2.9 精密度试验
2.9.1 重复性试验
按照规定的方法计算单个有关物质的量，并计算其制备的六份样品的 RSD。结果显示6份样品中，各杂质的量 RSD%不大于 10 %。
2.9.2溶液稳定性试验
取重复性加入各有关物质的样品溶液。在 0 天进行测定，按照规定的方法计算单个有关物质的量。将上述样品溶液分装成两份，一份储存于室温下，另一份储存于 4℃下，分别于 1天、2天进样，计算单个有关物质的量。结果显示：单个有关物质的量差值应不超过 0.05 %。表示溶液稳定性良好。
2.9.3 样品检验 对制备的3批富马酸福莫特罗样品，按上述方法进行了配制，参照色谱条件进行有关物质测定并计算各杂质限度，结果见下表。
3 讨论
试验参照了USP37、BP2010及EP 7.0中测定富马酸富莫特罗有关物质所用的HPLC方法及有关资料，通过多次试验，最终确认以称取4.212g二水磷酸二氢钠，加水1000ml溶解并混匀（加磷酸调节PH为3.1±0.1）为流动相A，乙腈为流动相B，流速1.0ml/min，检测波长为214nm，采用梯度洗脱。在此条件下，各杂质峰分离度良好，峰形及出峰时间理想，系统稳定性好，并具有良好的准确性和重复性，表明该方法适合富马酸富莫特罗有关物质的测定。■
参考文献
[1] 傅龙，许东雷等. 中国药品检验标准操作规范. 北京：中国医药科技出版社，2005，79-94.
关键词：高效液相色谱法；富马酸福莫特罗；有关物质
富马酸福莫特罗是一种长效β2——受体激动剂，具有长效，高选择性，副作用小的显著特点，临床上广泛用于哮喘。本实验参照USP37的色谱条件，建立HPLC测定富马酸福莫特罗有关物质的方法。
1 仪器和试药
美国Waters e2695高效液相色谱仪：2489紫外检测器，A10707051Z四元泵，A105CH251G柱温箱，Empower 3色谱工作站，KQ5200B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）.富马酸福莫特罗工作对照品：自制（滴定纯度99.9%），杂质G、A、C、E对照品由上海医药工业研究院提供。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为制药用注射用水。
2 方法和结果
2.1色谱条件与系统适应性试验 色谱柱：采用 Agilent，ZORBAX SB-C8 column（150 mm × 4.6 mm，5 um）， 称取4.212g二水磷酸二氢钠，加水1000ml溶解并混匀（加磷酸调节PH为3.1±0.1）为流动相A，乙腈为流动相B，流速1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温：25℃，进样量：20ul，理论塔板数按福莫特罗峰计算不低于2000。
2.2稀释剂溶液的配制 稀释剂：含0.037mol/L磷酸二氢钠和0.005mol/L磷酸氢二钠的水溶液，pH为6.0±0.1）-乙腈（84：16）
2.3 空白干扰试验 取制药用注射用水为空白溶液，精密进样20ul，记录色谱图。
2.4 系统适应性溶液的配制 称取富马酸福莫特罗对照品和富马酸福莫特罗杂质C对照品适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含富马酸福莫特罗200μg以及富马酸福莫特罗杂质C0.4μg的系统适用性溶液，量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.5 样品溶液的配制 富马酸福莫特罗样品20mg，精密称定，置100mL量瓶中，加稀释剂约50mL，超声溶解。放冷至室温，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，配成0.2mg/mL的样品溶液。
2.6 专属性试验 考察空白溶剂或其他有关物质存在情况下，样品中有关物质的测定是否受到干扰。
2.6.1空白溶剂、富马酸福莫特罗系统适用性溶液、样品溶液均按照方法描述配制。在方法规定的色谱条件下进样，并记录色谱图。
2.6.2 空白溶剂在富马酸福莫特罗及其各有关物质出峰处没有干扰。各峰与各待测杂质之间，各峰与主峰之间的分离度均大于 1.5，且主峰与杂质 C 的分离度大于 1.5，各待测杂质之间的分离度也同样大于1.5。
2.7 线性范围试验
2.7.1制备富马酸福莫特罗及杂质 G、A、C、E 对照品配制成0.2mg/mL的储备溶液。精密移取富马酸福莫特罗储备溶液、杂质 E 对照品储备溶液、杂质 G 对照品储备溶液各 1ml、杂质 C 对照品储备溶液2ml、杂质 A 对照品储备溶液3mL，稀释 500 倍制成线性测试对照品混合储备溶液。
2.7.2 结果：富马酸福莫特罗峰面积对浓度的线性回归方程为 y = 86.573x - 0.1523，线性相关系数 r= 0.999，Y 轴截距值小于定量限响应值的±50%；
结果显示该方法在各限度浓度的 QL～150%的浓度范围内响应值与浓度呈现良好线性，线性范围满足要求。
2.8准确度试验
2.8.1按照规定的方法制备样品溶液；制备杂质限度水平的 50%、100%和 150%水平的杂质储备溶液，每个水平平行制备三份，并用上述杂质储备溶液作为溶剂，制备成杂质浓度分别为限度水平的 50%、100%和 150%水平的九份样品溶液。在方法规定的色谱条件进样 。
2.8.2 在富马酸福莫特罗原料药杂质限度水平的 50%、100%、150%三个浓度下，分别计算各有关物质的回收率，考察方法的准确度，回收率结果显示：杂质 G 在 9 份样品的回收率均在 80.0%～120.0% 范围内，平均回收率为 110.1%， RSD 为 1.2%。
2.9 精密度试验
2.9.1 重复性试验
按照规定的方法计算单个有关物质的量，并计算其制备的六份样品的 RSD。结果显示6份样品中，各杂质的量 RSD%不大于 10 %。
2.9.2溶液稳定性试验
取重复性加入各有关物质的样品溶液。在 0 天进行测定，按照规定的方法计算单个有关物质的量。将上述样品溶液分装成两份，一份储存于室温下，另一份储存于 4℃下，分别于 1天、2天进样，计算单个有关物质的量。结果显示：单个有关物质的量差值应不超过 0.05 %。表示溶液稳定性良好。
2.9.3 样品检验 对制备的3批富马酸福莫特罗样品，按上述方法进行了配制，参照色谱条件进行有关物质测定并计算各杂质限度，结果见下表。
3 讨论
试验参照了USP37、BP2010及EP 7.0中测定富马酸富莫特罗有关物质所用的HPLC方法及有关资料，通过多次试验，最终确认以称取4.212g二水磷酸二氢钠，加水1000ml溶解并混匀（加磷酸调节PH为3.1±0.1）为流动相A，乙腈为流动相B，流速1.0ml/min，检测波长为214nm，采用梯度洗脱。在此条件下，各杂质峰分离度良好，峰形及出峰时间理想，系统稳定性好，并具有良好的准确性和重复性，表明该方法适合富马酸富莫特罗有关物质的测定。■
参考文献
[1] 傅龙，许东雷等. 中国药品检验标准操作规范. 北京：中国医药科技出版社，2005，79-94.