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摘要：病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，简称VIGS）技术在候选基因功能验证方面起着非常重要的作用。以辣椒八氢番茄红素脱氢酶基因（简称PDS）为目标基因，分析表达载体转化农杆菌的菌液在LB液体培养基和诱导培养基（IM）中D600 nm值的变化趋势。结果表明，当LB液体培养基中菌液D600 nm值为1.15时，后续利用IM培养菌液的效率最高，PDS基因沉默效果明显；优化了农杆菌接种方法，可为辣椒利用VIGS技术进行候选基因的功能验证提供参考。
关键词：辣椒；VIGS；农杆菌接种；基因沉默
中图分类号： Q786文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0082-03
病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，简称VIGS）是通过携带靶基因的病毒侵染植株从而引起寄主植株对应的目标基因沉默，使该基因不能继续表达，进而探究基因功能的一种方式[1-2]。目前，VIGS技术已被广泛应用，棉花[3]、烟草[4]、拟南芥[5]、大麦[6]、大豆[7]等植物都已经成功构建了VIGS体系，茄科作物[8-10]也开始普遍利用VIGS技术研究基因功能。候选基因VIGS载体构建成功后，农杆菌接种侵染植株是VIGS的关键步骤，农杆菌菌液培养占据了大量的时间，其中菌液的D600 nm值是试验的关键点。沉默八氢番茄红素脱氢酶基因（简称PDS）可使植株出现明显的白化症状，PDS基因常用作VIGS试验的阳性对照基因[11]。本试验以PDS为目标基因构建VIGS载体接种辣椒，分析在农杆菌振荡培养过程中菌液的D600 nm值，从而简化摇菌的测量次数，为利用VIGS方法进行候选基因功能验证提供参考。
1材料与方法
1.1试验材料
供试辣椒材料为江苏省农业科学院蔬菜研究所高效園艺作物遗传改良重点实验室保存的G43（Capsicum annuum L.）。VIGS载体pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS转化农杆菌GV3101菌液引自西北农林科技大学。
1.2试验方法
1.2.1植物材料培养2015年10月，利用RGL-P1000D人工气候箱育苗，出苗前30 ℃、黑暗培养，出苗后，昼、夜温度28、20 ℃，光照375 μmol/（m2·s）（光照—黑暗为12 h—12 h），湿度60%，培养至2张子叶完全展开、真叶尚未长出时用于接种。
1.2.2试剂配制试剂的配制参照Velásquez等[12]所述，配制体积稍有改动。
20×AB盐配制：NH4Cl 20.00 g、MgSO4·7H2O 6.00 g、KCl 3.00 g、CaCl2 0.20 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，用超纯水定容至1 L，121 ℃灭菌20 min（若出现沉淀，需要涡旋），备用。
诱导培养基（IM）配制：2-（N-吗啉）乙磺酸一水合物（MES）5.137 g、葡萄糖2.632 g、NaH2PO4 0.164 g，用超纯水定容至500 mL，调节pH值为5.6，121 ℃灭菌20 min，待溶液冷却后加AB盐26.316 mL。IM当天或提前1 d配制，500 mL IM使用前加入500 μL 200 mmol/L乙酰丁香酮、26.316 mL 20×AB盐、500 μL 50 mg/mL卡那霉素、利福平、庆大霉素。
200 mmol/L乙酰丁香酮配制：19.6 mg乙酰丁香酮溶于500 μL二甲基亚砜（DMSO）。
乙磺酸（MES）溶液配制：MgCl2·6H2O 1.016 5 g，MES 1.066 0 g，用超纯水定容至500 mL，调节pH值至5.5，121 ℃灭菌 20 min。
1.3接种方法
参照Velásquez等[12-13]的方法。
1.3.1划板在-80 ℃冰箱中取出pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS转化农杆菌GV3101菌液，冰上融解，分别在三抗LB琼脂板（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、50 mg/L 庆大霉素）上划线，用封口膜封好，标注好名称及日期，置于28 ℃培养36 h左右。
1.3.2挑取单菌落培养准备3个100 mL锥形瓶，分别加入10 mL液体LB培养基（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、50 mg/L庆大霉素），再分别挑取pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS单菌落至锥形瓶中，用封口膜封好，28 ℃、200 r/min 培养。
1.3.3IM摇菌按1 ∶[KG-*3]25的比例混合菌液和IM。pTRV1配制2瓶，pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS各配1瓶，28 ℃、200 r/min 培养27 ～37 h至菌液D600 nm值达到0.5 ～0.8。
1.3.4收集菌体将菌液分别移入50 mL离心管中，4 ℃、3 000 g 离心10 min，移除液体，加入等体积MES重悬，4 ℃、3 000 g 再次离心10 min，收集菌体，用1/2体积的MES重悬。向pTRV1内加入200 mmol/L乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮终浓度为400 mmol/L，按1 ∶[KG-*3]1将pTRV1分别与pTRV2 ∶[KG-*3]
00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS混合，使乙酰丁香酮终浓度为200 mmol/L，D600 nm值约为0.6，置于22～25 ℃静置3～5 h，用于注射接种。
1.3.5接种幼苗接种前1 d浇水。接种时，在子叶中下部靠近叶脉处用2 mL一次性注射器打孔，用无针头的一次性注射器在子叶背面注射菌液，直至整张子叶充满水渍。注意在注射不同菌液时要更换手套与注射器，避免交叉污染。
关键词：辣椒；VIGS；农杆菌接种；基因沉默
中图分类号： Q786文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0082-03
病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，简称VIGS）是通过携带靶基因的病毒侵染植株从而引起寄主植株对应的目标基因沉默，使该基因不能继续表达，进而探究基因功能的一种方式[1-2]。目前，VIGS技术已被广泛应用，棉花[3]、烟草[4]、拟南芥[5]、大麦[6]、大豆[7]等植物都已经成功构建了VIGS体系，茄科作物[8-10]也开始普遍利用VIGS技术研究基因功能。候选基因VIGS载体构建成功后，农杆菌接种侵染植株是VIGS的关键步骤，农杆菌菌液培养占据了大量的时间，其中菌液的D600 nm值是试验的关键点。沉默八氢番茄红素脱氢酶基因（简称PDS）可使植株出现明显的白化症状，PDS基因常用作VIGS试验的阳性对照基因[11]。本试验以PDS为目标基因构建VIGS载体接种辣椒，分析在农杆菌振荡培养过程中菌液的D600 nm值，从而简化摇菌的测量次数，为利用VIGS方法进行候选基因功能验证提供参考。
1材料与方法
1.1试验材料
供试辣椒材料为江苏省农业科学院蔬菜研究所高效園艺作物遗传改良重点实验室保存的G43（Capsicum annuum L.）。VIGS载体pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS转化农杆菌GV3101菌液引自西北农林科技大学。
1.2试验方法
1.2.1植物材料培养2015年10月，利用RGL-P1000D人工气候箱育苗，出苗前30 ℃、黑暗培养，出苗后，昼、夜温度28、20 ℃，光照375 μmol/（m2·s）（光照—黑暗为12 h—12 h），湿度60%，培养至2张子叶完全展开、真叶尚未长出时用于接种。
1.2.2试剂配制试剂的配制参照Velásquez等[12]所述，配制体积稍有改动。
20×AB盐配制：NH4Cl 20.00 g、MgSO4·7H2O 6.00 g、KCl 3.00 g、CaCl2 0.20 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，用超纯水定容至1 L，121 ℃灭菌20 min（若出现沉淀，需要涡旋），备用。
诱导培养基（IM）配制：2-（N-吗啉）乙磺酸一水合物（MES）5.137 g、葡萄糖2.632 g、NaH2PO4 0.164 g，用超纯水定容至500 mL，调节pH值为5.6，121 ℃灭菌20 min，待溶液冷却后加AB盐26.316 mL。IM当天或提前1 d配制，500 mL IM使用前加入500 μL 200 mmol/L乙酰丁香酮、26.316 mL 20×AB盐、500 μL 50 mg/mL卡那霉素、利福平、庆大霉素。
200 mmol/L乙酰丁香酮配制：19.6 mg乙酰丁香酮溶于500 μL二甲基亚砜（DMSO）。
乙磺酸（MES）溶液配制：MgCl2·6H2O 1.016 5 g，MES 1.066 0 g，用超纯水定容至500 mL，调节pH值至5.5，121 ℃灭菌 20 min。
1.3接种方法
参照Velásquez等[12-13]的方法。
1.3.1划板在-80 ℃冰箱中取出pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS转化农杆菌GV3101菌液，冰上融解，分别在三抗LB琼脂板（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、50 mg/L 庆大霉素）上划线，用封口膜封好，标注好名称及日期，置于28 ℃培养36 h左右。
1.3.2挑取单菌落培养准备3个100 mL锥形瓶，分别加入10 mL液体LB培养基（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、50 mg/L庆大霉素），再分别挑取pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS单菌落至锥形瓶中，用封口膜封好，28 ℃、200 r/min 培养。
1.3.3IM摇菌按1 ∶[KG-*3]25的比例混合菌液和IM。pTRV1配制2瓶，pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS各配1瓶，28 ℃、200 r/min 培养27 ～37 h至菌液D600 nm值达到0.5 ～0.8。
1.3.4收集菌体将菌液分别移入50 mL离心管中，4 ℃、3 000 g 离心10 min，移除液体，加入等体积MES重悬，4 ℃、3 000 g 再次离心10 min，收集菌体，用1/2体积的MES重悬。向pTRV1内加入200 mmol/L乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮终浓度为400 mmol/L，按1 ∶[KG-*3]1将pTRV1分别与pTRV2 ∶[KG-*3]
00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS混合，使乙酰丁香酮终浓度为200 mmol/L，D600 nm值约为0.6，置于22～25 ℃静置3～5 h，用于注射接种。
1.3.5接种幼苗接种前1 d浇水。接种时，在子叶中下部靠近叶脉处用2 mL一次性注射器打孔，用无针头的一次性注射器在子叶背面注射菌液，直至整张子叶充满水渍。注意在注射不同菌液时要更换手套与注射器，避免交叉污染。