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摘 要：目的：探讨有氧运动对慢性脑缺血小鼠干预效果及PI3K/Akt信号通路的影响。方法：参考Yoshizaki建立的小鼠慢性脑缺血模型，选择KM小鼠为实验动物，构建小鼠慢性脑缺血模型；应用神经行为学分析、尼氏染色、免疫组化实验技术，比较有氧运动对该模型的干预效果，探讨其神经保护作用的机制；建模成功后，将小鼠随机四组：SO组、M组、SW组、TM组。SW组：术后3～4天适应性游泳30分钟，继后每天递增10分钟，逐渐延长至60分钟，持续6周，每周休息1天。TM组：术后第1周进行3次适应性跑台训练，每次60分钟，每周6次，持续6周。结论：两种有氧运动均能对本模型的脑细胞发挥抗损伤作用，且其干预效果TM组优于SW组；两种有氧运动可能均通过调节PI3K /Akt信号通路的表达，达到抑制细胞凋亡，发挥其抗脑组织伤害的作用。
关键词：有氧运动；慢性脑缺血；PI3K；Akt；信号通路
慢性脑缺血是指各种原因引发的长期脑血流灌注不足，为临床上常见的脑损伤之一，可导致持久或进展性的认知与神经功能障碍[1]。
细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是细胞在某些生理或病理条件下发生的有序的主动性非炎症性死亡。研究认为，脑缺血后与细胞凋亡有关的信号转导通路主要有有丝分裂原蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K） /丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路[2]。Akt又名蛋白激酶B（PKB），为分子量大约为60 kD的蛋白激酶。Akt能使丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）磷酸化，故又称为丝氨酸/苏氨酸激酶。Akt能介导多种生物学效应，是重要的抗凋亡调节因子。因子PI32K激活的Akt可以介导胰岛素、多种生长因子、凝血酶等诱发的细胞生长，能经多种途径促进细胞存活[3]。
本研究采用结扎右颈动脉的方法构建了小鼠酒精性肝损伤模型，采用跑台和游泳两种不同的有氧运动方式干预，通过神经行为学、显微结构形态学观察以上干预对脑缺血损伤小鼠的影响；采用免疫组化实验技术，检测PI3K/Akt信号通路上下游相关因子的差異表达，探讨其神经保护作用的机制。
1.研究方法
（1）动物模型的构建：成年健康雄性KM小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠（0.3ml/100g体重），参考Yoshizaki的方法结扎小鼠右颈动脉构建慢性脑缺血损伤小鼠动物模型。
（2）实验动物分组以及运动方案：建模成功后，将小鼠随机分为四组：假手术组（SO）、模型对照组（M）、游泳组（SW）、跑台组（TM），每组10只，建模后3—4天对其进行干预。
（3）组织形态学观察：实验结束后，取小鼠脑组织进行石蜡包埋，尼氏染色，解剖形态学观察。
（4）神经行为学评估：Clark神经功能评分方法，根据症状表现程度分0、1、2、3、4递增等级，对小鼠步态、攀爬能力、转圈、胡须反应、眼睛、耳朵、毛发等的情况进行综合评分。
（5）免疫组织化学分析：检测缺血脑组织中的PI3K、Akt、mTOR的表达，采用SABC法的免疫组织化学法进行以上因子的定位和半定量表达检测。在10×20倍光学显微镜下，观察并计算PI3K、AKT、mTOR的阳性表达面积百分比[4]（阳性反应面积/测量面积）。
2.结果与分析
（1）小鼠神经行为学评估：分别记录建模后无干预和建模后进行有氧干预的得分（三次评分取平均值）。
（2）解剖形态学观察：组小鼠尼氏体排列紧密，大且数量较多，神经元受损程度小；M组排列疏、欠规整，且数量较少；与M组相比，SW、TM组中尼氏体数量较多，排列紧密，仅次于SO组，TM排列有规则较集中，效果优于SW组。
（3）免疫组织化学分析。图2显示：小鼠脑细胞PI3K、Akt主要表达于细胞浆。PI3K表达强弱依次为SO>TM>SW>M组；Akt表达强到弱依次为SO>TM>SW>M组。
表2可见：小鼠脑组织中PI3K、Akt免疫组化中SO组阳性表达最高，SW组、TM组表达均高于M组（P<0.01），且TM组表达更显著；与M组的Akt表达相比，SO组的Akt表达具有非常显著的差异（P<0.01）。
3.讨论
（1）小鼠脑缺血模型。脑缺血理想的实验动物模型是实验研究取得进展的关键性因素之一。由于本实验需要进行长时间的有氧游泳和跑台的运动训练，我们对所选小鼠的右颈动脉进行结扎以构模。术后我们跟踪观察小鼠的情况，发现小鼠右眼半闭或全闭。这说明小鼠建模成功，且其成功率达90%，应用此模型可以顺利完成本研究。
（2）有氧运动对小鼠脑缺血干预的效果。近年来，大量有关有氧运动康复训练治疗急性缺血性脑血管疾病的动物实验取得了一定的成果。适当的运动训练能够促使脑血管新生，增强抗氧化能力，减轻脑细胞凋亡，促进神经元生长等。从本实验结果可见，对小鼠建模前、后以及有氧运动干预后神经功能的评分，除M组外，各干预组都有明显的变化。脑组织尼氏染色显示，相比于M组，有氧运动组尼氏小体相对清楚有规律，TM组尤为显著，这说明有氧运动对小鼠脑部神经元细胞的再生以及保护有着重要的作用，其能促进神经干细胞增殖以及分化，促进轴突及树突的生长。
（3）有氧运动干预与PI3K/Akt信号通路表达影响。脑缺血后与细胞凋亡有关的信号转导通路主要有有丝分裂原蛋白激酶（ MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K） /丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路。PI3K是一种可使肌醇环第三位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶。PI3K被激活后生成的磷脂产物进一步激活Akt及其下游的信号的级联反应， 参与生长、发育、分化和细胞的存活。PI3K激活的Akt可以介导胰岛素、多种生长因子、凝血酶等诱发的细胞生长，能经多种途径促进细胞存活。从小鼠脑组织免疫组织化学结果的分析可见，PI3K/Akt的表达情况在游泳组和跑台组的表达面积远高于模型对照组、低于假手术组，且跑台组表达面积更佳。由此可知，有氧运动对该模型中的鼠脑组织发挥着保护作用，能抑制细胞的凋亡过程。其抗损伤作用机理可能通过激活PI32K /Akt信号通路的表达，达到抑制细胞凋亡，发挥脑组织保护的作用。
4.结论
（1）两种有氧运动均能对本慢性脑缺血小鼠模型的脑细胞发挥抗损伤作用，且其效果跑台组优于游泳组。
（2）两种有氧运动可能均通过调节PI32K /Akt信号通路的表达，达到抑制细胞凋亡，发挥抗脑组织伤害作用。
参考文献：
[1]杨运华.运动对胰岛素抵抗状态下胰岛素PI3K/Akt/GSK-3信号传导通路影响的研究进展[J].长江大学学报（自然科学版），2013（21）：142-145.
[2]黄秀兰，崔国辉，周克元.PI3K/Akt信号通路与肿瘤细胞凋亡关系的研究进展[J].癌症，2008，27（3）：331-336.
[3]朱裕华，袁红花，吴连连，等.IGF-1通过PI3K/Akt信号诱导神经干细胞向神经元分化[J].山东大学学报（医学版），2014，52（3）： 11-15.
[4]郭 琳，王 强.PI3K/mTOR信号传导通路与恶性肿瘤浸润和转移的研究进展[J].现代肿瘤医学，2009， 17（8）：1585-1589.
（作者单位：湖南师范大学体适能与运动康复湖南省重点实验室）
关键词：有氧运动；慢性脑缺血；PI3K；Akt；信号通路
慢性脑缺血是指各种原因引发的长期脑血流灌注不足，为临床上常见的脑损伤之一，可导致持久或进展性的认知与神经功能障碍[1]。
细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是细胞在某些生理或病理条件下发生的有序的主动性非炎症性死亡。研究认为，脑缺血后与细胞凋亡有关的信号转导通路主要有有丝分裂原蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K） /丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路[2]。Akt又名蛋白激酶B（PKB），为分子量大约为60 kD的蛋白激酶。Akt能使丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）磷酸化，故又称为丝氨酸/苏氨酸激酶。Akt能介导多种生物学效应，是重要的抗凋亡调节因子。因子PI32K激活的Akt可以介导胰岛素、多种生长因子、凝血酶等诱发的细胞生长，能经多种途径促进细胞存活[3]。
本研究采用结扎右颈动脉的方法构建了小鼠酒精性肝损伤模型，采用跑台和游泳两种不同的有氧运动方式干预，通过神经行为学、显微结构形态学观察以上干预对脑缺血损伤小鼠的影响；采用免疫组化实验技术，检测PI3K/Akt信号通路上下游相关因子的差異表达，探讨其神经保护作用的机制。
1.研究方法
（1）动物模型的构建：成年健康雄性KM小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠（0.3ml/100g体重），参考Yoshizaki的方法结扎小鼠右颈动脉构建慢性脑缺血损伤小鼠动物模型。
（2）实验动物分组以及运动方案：建模成功后，将小鼠随机分为四组：假手术组（SO）、模型对照组（M）、游泳组（SW）、跑台组（TM），每组10只，建模后3—4天对其进行干预。
（3）组织形态学观察：实验结束后，取小鼠脑组织进行石蜡包埋，尼氏染色，解剖形态学观察。
（4）神经行为学评估：Clark神经功能评分方法，根据症状表现程度分0、1、2、3、4递增等级，对小鼠步态、攀爬能力、转圈、胡须反应、眼睛、耳朵、毛发等的情况进行综合评分。
（5）免疫组织化学分析：检测缺血脑组织中的PI3K、Akt、mTOR的表达，采用SABC法的免疫组织化学法进行以上因子的定位和半定量表达检测。在10×20倍光学显微镜下，观察并计算PI3K、AKT、mTOR的阳性表达面积百分比[4]（阳性反应面积/测量面积）。
2.结果与分析
（1）小鼠神经行为学评估：分别记录建模后无干预和建模后进行有氧干预的得分（三次评分取平均值）。
（2）解剖形态学观察：组小鼠尼氏体排列紧密，大且数量较多，神经元受损程度小；M组排列疏、欠规整，且数量较少；与M组相比，SW、TM组中尼氏体数量较多，排列紧密，仅次于SO组，TM排列有规则较集中，效果优于SW组。
（3）免疫组织化学分析。图2显示：小鼠脑细胞PI3K、Akt主要表达于细胞浆。PI3K表达强弱依次为SO>TM>SW>M组；Akt表达强到弱依次为SO>TM>SW>M组。
表2可见：小鼠脑组织中PI3K、Akt免疫组化中SO组阳性表达最高，SW组、TM组表达均高于M组（P<0.01），且TM组表达更显著；与M组的Akt表达相比，SO组的Akt表达具有非常显著的差异（P<0.01）。
3.讨论
（1）小鼠脑缺血模型。脑缺血理想的实验动物模型是实验研究取得进展的关键性因素之一。由于本实验需要进行长时间的有氧游泳和跑台的运动训练，我们对所选小鼠的右颈动脉进行结扎以构模。术后我们跟踪观察小鼠的情况，发现小鼠右眼半闭或全闭。这说明小鼠建模成功，且其成功率达90%，应用此模型可以顺利完成本研究。
（2）有氧运动对小鼠脑缺血干预的效果。近年来，大量有关有氧运动康复训练治疗急性缺血性脑血管疾病的动物实验取得了一定的成果。适当的运动训练能够促使脑血管新生，增强抗氧化能力，减轻脑细胞凋亡，促进神经元生长等。从本实验结果可见，对小鼠建模前、后以及有氧运动干预后神经功能的评分，除M组外，各干预组都有明显的变化。脑组织尼氏染色显示，相比于M组，有氧运动组尼氏小体相对清楚有规律，TM组尤为显著，这说明有氧运动对小鼠脑部神经元细胞的再生以及保护有着重要的作用，其能促进神经干细胞增殖以及分化，促进轴突及树突的生长。
（3）有氧运动干预与PI3K/Akt信号通路表达影响。脑缺血后与细胞凋亡有关的信号转导通路主要有有丝分裂原蛋白激酶（ MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K） /丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路。PI3K是一种可使肌醇环第三位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶。PI3K被激活后生成的磷脂产物进一步激活Akt及其下游的信号的级联反应， 参与生长、发育、分化和细胞的存活。PI3K激活的Akt可以介导胰岛素、多种生长因子、凝血酶等诱发的细胞生长，能经多种途径促进细胞存活。从小鼠脑组织免疫组织化学结果的分析可见，PI3K/Akt的表达情况在游泳组和跑台组的表达面积远高于模型对照组、低于假手术组，且跑台组表达面积更佳。由此可知，有氧运动对该模型中的鼠脑组织发挥着保护作用，能抑制细胞的凋亡过程。其抗损伤作用机理可能通过激活PI32K /Akt信号通路的表达，达到抑制细胞凋亡，发挥脑组织保护的作用。
4.结论
（1）两种有氧运动均能对本慢性脑缺血小鼠模型的脑细胞发挥抗损伤作用，且其效果跑台组优于游泳组。
（2）两种有氧运动可能均通过调节PI32K /Akt信号通路的表达，达到抑制细胞凋亡，发挥抗脑组织伤害作用。
参考文献：
[1]杨运华.运动对胰岛素抵抗状态下胰岛素PI3K/Akt/GSK-3信号传导通路影响的研究进展[J].长江大学学报（自然科学版），2013（21）：142-145.
[2]黄秀兰，崔国辉，周克元.PI3K/Akt信号通路与肿瘤细胞凋亡关系的研究进展[J].癌症，2008，27（3）：331-336.
[3]朱裕华，袁红花，吴连连，等.IGF-1通过PI3K/Akt信号诱导神经干细胞向神经元分化[J].山东大学学报（医学版），2014，52（3）： 11-15.
[4]郭 琳，王 强.PI3K/mTOR信号传导通路与恶性肿瘤浸润和转移的研究进展[J].现代肿瘤医学，2009， 17（8）：1585-1589.
（作者单位：湖南师范大学体适能与运动康复湖南省重点实验室）