论文部分内容阅读
摘要：目的 探讨甲状腺癌不同证型患者的唾液蛋白表达质谱的差异并构建诊断模型，为甲状腺癌的中医辨证分型提供客观依据。方法 应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术分别检测23例痰瘀互结型和26例肝郁气滞型甲状腺癌患者的唾液蛋白质指纹图谱，筛选出2组间特异性表达差异蛋白，并结合生物信息学方法建立诊断模型。结果 通过2组唾液蛋白质指纹图谱数据比较，共获得29个有明显差异的蛋白峰（P<0.01），其中M/Z 3809.85、3 110.04、4 970.80被选择用于构建最佳决策树模型，该模型的测试组总准确率为85.7%（42/49），灵敏度为84.6%（22/26），特异性为86.9%（20/23）。结论 初步建立了甲状腺癌的唾液蛋白质指纹图谱辨证模式，为中医证候实质研究提供了新的方法和途径。
关键词：甲状腺癌；唾液；中医证候；蛋白质组学；表面增强激光解析电离飞行时间质谱
中图分类号：R273.61 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）04-0013-03
甲状腺癌为常见的恶性肿瘤之一，发病率占头颈部恶性肿瘤发病率的首位[1]，且有年轻化趋势。甲状腺癌属于中医“瘿瘤”范畴，中医辨证论治甲状腺癌积累了丰富的经验，且取得了很好的的疗效。但中医证候缺乏物质基础和客观的实验室特异性指标，临床上带有很大的主观性。蛋白质组学（proteomics）是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，研究技术主要包括蛋白质的分离、鉴定，蛋白质芯片及生物信息学等一些先进的技术。其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。蛋白质组的整体性、动态性、时空性、复杂性等特点和中医“证”有着惊人的相似，其中可能存在某种内在联系和对应关系[2]。表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术是蛋白组学研究中的一个新的高通量的技术平台，本研究应用SELDI-TOF-MS技术检测甲状腺癌不同证型患者唾液样品的蛋白质指纹图谱，探讨不同证候唾液蛋白表达差异的变化规律。
1 资料与方法
1.1 研究对象
2008年10月-2009年9月，在深圳市第二人民医院初次住院治疗，经病理学证实为甲状腺癌，且符合中医肝郁气滞或痰瘀互结证型的49例患者，并排除其他系统相关疾病。本试验经本院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。在入院时（治疗前）采集唾液样本。其中肝郁气滞组26例，女性24例，男性2例，年龄24～55岁，中位年龄42岁；痰瘀互结组23例，女性19例，男性4例，年龄25～57岁，中位年龄43岁。经统计学分析，2组性别、年龄差异无统计学意义（P>0.05）。
1.2 中医辨证标准
参照《中医病证诊断疗效标准》[3]中的证型标准。①肝郁气滞型：情志抑郁、胸闷不舒，心悸易汗，口干、便秘；颈部肿物，质坚硬，活动度范围小或不随吞咽上下移动，遇郁怒肿块增大；妇女可见乳房作胀疼痛，月经不调；舌质淡红，苔薄白或微黄，脉弦。②痰瘀互结型：病程较长，胸闷痰多、肢体倦怠、胃纳不佳、颈部肿块质硬，表面不平，随吞咽上下移动受限或推之不动，或伴有淋巴结的转移，多伴有疼痛；舌质多紫黯或有斑点，舌苔多厚腻，脉象可见弦滑或沉涩。
1.3 主要试剂与仪器
PBSⅡ-C型蛋白质芯片阅读仪、NP20芯片均为美国Ciphergen公司产品。纯水（HPLC级）、SPA（Sinapinic acid）、乙氰、三氟乙酸均购自美国Sigma公司。
1.4 研究方法
1.4.1 唾液样本的收集与处理 晨起空腹时采集唾液样本，收集到15 mL离心管中，4 ℃下静置1 h后， 10 000 r/min、4 ℃下离心10 min。冰浴上分装在1 mL EP管中，每管50 ?L，于-80 ℃冰箱保存。实验时取出样本，冰上解冻，所有检测唾液样本均1次冻融，4 ℃下离心5 min备用。
1.4.2 芯片的处理和样品检测 取唾液上清，每条芯片的每个点直接上样4 ?L，自然晾干后重复上样1次，待干后将芯片装入96孔蛋白质芯片工作支架Bio-Processor中，每孔加入10 ?L纯水，置振荡器上6O0 r/min、4 ℃下振荡10 min，甩掉，拍干，重复1次。将芯片从Bio-Processor中取出，自然晾干后每点加半饱和SPA溶液0.5 ?L，重复1次，待干后即可上机检测。
1.4.3 数据采集 设置激光强度为220，灵敏度为9，收集数据的质荷比范围为2 000～20 000 M/Z，优化范围为2 000～15 000 M/Z，信号收集位置20～80，平均每点收集20次，收集总点数为140次。用Ciphergen Proteinchip Software3.2.1软件自动采集数据，纵坐标为峰强度（蛋白质相对含量），横坐标为蛋白质质荷比（M/Z）。
1.5 统计学方法
所有原始数据先用Proteinchip Software3.2.1做总离子强度及分子量校正，使其达到均一。对位于2 000～20 000 M/Z峰值，用Biomarker Wizard软件过滤噪音。设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，以10%为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，Mann-Whitney秩和检验比较2组唾液蛋白质质谱数据（由Biomarker Wizard软件完成），找出2组之间表达差异有统计学意义的蛋白质峰。用Biomaker Pattern Software5.0.2采用决策树算法计算出多个变量（M/Z蛋白质质谱峰）变化对两样本的分类价值，确定最佳的筛选模型，即诊断模型。
2 结果 2.1 唾液蛋白质谱分析
本研究所有唾液蛋白指纹图谱数据经聚类后共得到稳定表达的蛋白质峰225个。M/Z位于2 000～20 000的波峰有183个，其中有29个蛋白质峰在2组之间表达量差异有统计学意义（P<0.01），11个蛋白质峰在痰瘀互结组中高表达，18个蛋白质峰在肝郁气滞组中高表达。其中P值最小的15个代表性的蛋白质峰见表1。
2.2 诊断模型的建立
经Biomarker Pattern Software5.0.2软件分析后，从上述差异蛋白质峰中选出M/Z为3 809.85、3 110.04、4 970.80的3个蛋白质峰构建决策树分类诊断模型。M/Z 3 809.85、3 110.04、4 970.80在肝郁气滞组表达量均显著增高（见表1）。
此模型分出4个终结点，训练组23例痰瘀互结型甲状腺癌全部被准确诊断，26例肝郁气滞型有24例模型被准确诊断，训练组判别总准确率为95.9%（47/49），灵敏度为92.3% （24/26），特异性为100%（23/23），Youden指数为0.923。交叉验证（测试组）总准确率为85.7%（42/49），灵敏度为84.6% （22/26），特异性为86.9%（20/23），Youden指数为0.715，进一步计算该模型的ROC曲线下面积为0.967，提示该模型具有较好的诊断价值。
3 讨论
“证”是中医的一个特有的概念，对证的研究一直是中医现代化研究的重点。但由于多数实验指标缺乏特异性，因此很难用单一指标来作定性、定量、定位的说明，也难以反映中医证候的整体性和复杂性[4]。近些年开始从基因组学和蛋白质组学角度研究“证”实质，尤其是将蛋白质组学引入中医“证”的实质研究受到普遍重视。
人类基因组计划（HGP）全基因组测序的完成，标志着后基因时代的到来，蛋白质组学研究也有了飞快的发展。SELDI-TOF-MS技术提供了一个高通量和高灵敏度的蛋白质检测平台，目前已在医学的多个领域显示出广阔的应用前景。卢氏等[5]利用SELDI-TOF-MS技术检测甲状腺癌血清蛋白质组图谱，筛选特异的蛋白质标记物，结果区分甲状腺癌和正常人的诊断模型交叉检验敏感性为87.5%，特异性为80.0%，认为此技术检测甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱是早期诊断甲状腺癌的一种特异性强、敏感性高的新方法。王氏等[6]使用SELDI-TOF-MS检测乳头状甲状腺癌与正常人血清蛋白质指纹图谱，鉴定出的载脂蛋白C-Ⅰ、载脂蛋白C-Ⅲ、α-珠蛋白和β- 珠蛋白在乳头状甲状腺癌的诊断中具有一定的价值和广泛的应用前景。
唾液，中医学称之为“金津玉液”，是滋润濡养、化生血液、调节阴阳的重要物质。现代医学把口腔中的唾液称为全唾液，是口腔环境中最重要的成分。唾液中含有一系列具有重要生物学功能的蛋白质和多肽，血清中的很多组分在唾液中也有一定的反映。同时唾液取材方便、低成本性、安全性等优点，以及唾液与血清水平之间的联系使得唾液检测正在成为一种重要的诊断方法[7]。传统的生物化学方法只能研究唾液中少数蛋白质。随着后基因时代的到来，对于唾液蛋白质进行大规模研究即唾液蛋白质组学的研究，虽然才刚刚起步，却展现出巨大的优势及生命力[8]。Ryu等[9]采用SELDI-TOF-MS分析了41例干燥综合征患者和20例健康对照人群的唾液样本，发现疾病组相对分子质量为11.8、12.0、14.3、80.6、83.7 kDa的蛋白质较健康组显著增加。Wu等[10]在国内率先开展了胃溃疡、慢性胃炎、胃癌的病证结合唾液蛋白质组比较研究，首次发现了多种特异唾液蛋白，并初步建立了胃癌的唾液蛋白质组诊断模型。Raymond等[11-12]使用SELDI-TOF-MS检测全唾液的蛋白质组分，结果显示绝大多数的蛋白质峰集中于相对低分子量区域，同时，通过对阴离子、阳离子、亲水性等不同类型的蛋白质芯片比较分析，发现每种芯片都能捕获唾液中的蛋白质，可根据检测的唾液蛋白质分子量选取合适的芯片。本研究也成功地建立了甲状腺癌中医辨证分型的唾液诊断模型，检测出蛋白质峰集中在2 000～15 000 Da相对低分子量的区域。
本研究率先应用SELDI-TOF-MS技术检测甲状腺癌不同证型的唾液蛋白表达指纹图谱，筛选出组间有明显差异的29个蛋白质峰，选取M/Z 3 809.85、3 110.04、4 970.80建立诊断模型。交叉验证（测试组）总准确率为85.7%（42/49），灵敏度86.9%（20/23），特异性84.6%（22/26）。Youden指数为0.715，进一步计算该模型的ROC曲线下面积为0.967，提示该模型具有较好的诊断价值，其敏感性、特异性均达到了较高水平。初步建立了甲状腺癌唾液蛋白质指纹图谱辨证模式，为甲状腺癌的中医证候实质在蛋白质组学水平上提供了特异性指标和物质基础。但本研究只选用了临床常见的2种证型进行初步探讨，且样本量较小，因此，该模型需进一步大样本验证，并进一步研究多个证型间的唾液蛋白表达差异。
参考文献：
[1] 石臣磊，秦华东.甲状腺癌与超声探测甲状腺钙化研究的新进展[J].中国肿瘤临床，2008，35（18）：1073-1075.
[2] 胡学军，蔡光先，刘柏炎，等.蛋白质组学在中医“证”实质研究中的应用[J].中华中医药杂志，2008，23（2）：87-90.
[3] 国家中医药管理局.中医病证诊断疗效标准[S].南京：南京大学出版社，1994：42-43.
[4] 刘喜平.蛋白质组学与中医方正研究思考[J].中医杂志，2004，45（4）：247-248.
[5] 卢秀波，王利，王家祥，等.血清蛋白指纹图谱在甲状腺癌诊断中的应用[J].中华实验外科杂志，2006，23（6）：703-705. [6] 王家祥，董瑞，刘秋亮，等.乳头状甲状腺癌患者血清中特异性标志物的检测与鉴定[J].中华肿瘤杂志，2009，31（4）：265-268.
[7] 刘炜，平飞云.表面加强激光解析电离-飞行时间-质谱技术及其在唾液检测中的研究发展[J].口腔医学，2008，28（10）：554-557.
[8] 姜静，王松灵.唾液蛋白质组学研究进展[J].北京口腔医学，2007， 15（4）：233-235.
[9] Ryu OH， Atkinson JC， Hoehn GT， et al. Identification of parotid salivary biomarkers in Sjogren's syndrome by surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry and two-dimensional difference gel electrophoresis[J]. Rheumatology （Oxford），2006，45（9）：1077-1086.
[10] Wu ZZ， Wang JG， Zhang XL. Diagnostic model of saliva protein finger print analysis of patients with gastric cancer[J]. World J Gastroenterol，2009，15（7）：865-870.
[11] Raymond SP， Arnoud LF， Jolan DG， et al. SELDI-TOF-MS of saliva methodology and pre-treatment effects[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，847（1）：45-53.
[12] Raymond SP， Arnoud LF， Jolan DG， et al. Salivary protein/ peptide profiling with SELDI-TOF-MS[J]. Annals of the New York Academy of Sciences，2007，1098：498-503.
（收稿日期：2012-11-28，编辑：陈静）
关键词：甲状腺癌；唾液；中医证候；蛋白质组学；表面增强激光解析电离飞行时间质谱
中图分类号：R273.61 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）04-0013-03
甲状腺癌为常见的恶性肿瘤之一，发病率占头颈部恶性肿瘤发病率的首位[1]，且有年轻化趋势。甲状腺癌属于中医“瘿瘤”范畴，中医辨证论治甲状腺癌积累了丰富的经验，且取得了很好的的疗效。但中医证候缺乏物质基础和客观的实验室特异性指标，临床上带有很大的主观性。蛋白质组学（proteomics）是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，研究技术主要包括蛋白质的分离、鉴定，蛋白质芯片及生物信息学等一些先进的技术。其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。蛋白质组的整体性、动态性、时空性、复杂性等特点和中医“证”有着惊人的相似，其中可能存在某种内在联系和对应关系[2]。表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术是蛋白组学研究中的一个新的高通量的技术平台，本研究应用SELDI-TOF-MS技术检测甲状腺癌不同证型患者唾液样品的蛋白质指纹图谱，探讨不同证候唾液蛋白表达差异的变化规律。
1 资料与方法
1.1 研究对象
2008年10月-2009年9月，在深圳市第二人民医院初次住院治疗，经病理学证实为甲状腺癌，且符合中医肝郁气滞或痰瘀互结证型的49例患者，并排除其他系统相关疾病。本试验经本院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。在入院时（治疗前）采集唾液样本。其中肝郁气滞组26例，女性24例，男性2例，年龄24～55岁，中位年龄42岁；痰瘀互结组23例，女性19例，男性4例，年龄25～57岁，中位年龄43岁。经统计学分析，2组性别、年龄差异无统计学意义（P>0.05）。
1.2 中医辨证标准
参照《中医病证诊断疗效标准》[3]中的证型标准。①肝郁气滞型：情志抑郁、胸闷不舒，心悸易汗，口干、便秘；颈部肿物，质坚硬，活动度范围小或不随吞咽上下移动，遇郁怒肿块增大；妇女可见乳房作胀疼痛，月经不调；舌质淡红，苔薄白或微黄，脉弦。②痰瘀互结型：病程较长，胸闷痰多、肢体倦怠、胃纳不佳、颈部肿块质硬，表面不平，随吞咽上下移动受限或推之不动，或伴有淋巴结的转移，多伴有疼痛；舌质多紫黯或有斑点，舌苔多厚腻，脉象可见弦滑或沉涩。
1.3 主要试剂与仪器
PBSⅡ-C型蛋白质芯片阅读仪、NP20芯片均为美国Ciphergen公司产品。纯水（HPLC级）、SPA（Sinapinic acid）、乙氰、三氟乙酸均购自美国Sigma公司。
1.4 研究方法
1.4.1 唾液样本的收集与处理 晨起空腹时采集唾液样本，收集到15 mL离心管中，4 ℃下静置1 h后， 10 000 r/min、4 ℃下离心10 min。冰浴上分装在1 mL EP管中，每管50 ?L，于-80 ℃冰箱保存。实验时取出样本，冰上解冻，所有检测唾液样本均1次冻融，4 ℃下离心5 min备用。
1.4.2 芯片的处理和样品检测 取唾液上清，每条芯片的每个点直接上样4 ?L，自然晾干后重复上样1次，待干后将芯片装入96孔蛋白质芯片工作支架Bio-Processor中，每孔加入10 ?L纯水，置振荡器上6O0 r/min、4 ℃下振荡10 min，甩掉，拍干，重复1次。将芯片从Bio-Processor中取出，自然晾干后每点加半饱和SPA溶液0.5 ?L，重复1次，待干后即可上机检测。
1.4.3 数据采集 设置激光强度为220，灵敏度为9，收集数据的质荷比范围为2 000～20 000 M/Z，优化范围为2 000～15 000 M/Z，信号收集位置20～80，平均每点收集20次，收集总点数为140次。用Ciphergen Proteinchip Software3.2.1软件自动采集数据，纵坐标为峰强度（蛋白质相对含量），横坐标为蛋白质质荷比（M/Z）。
1.5 统计学方法
所有原始数据先用Proteinchip Software3.2.1做总离子强度及分子量校正，使其达到均一。对位于2 000～20 000 M/Z峰值，用Biomarker Wizard软件过滤噪音。设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，以10%为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，Mann-Whitney秩和检验比较2组唾液蛋白质质谱数据（由Biomarker Wizard软件完成），找出2组之间表达差异有统计学意义的蛋白质峰。用Biomaker Pattern Software5.0.2采用决策树算法计算出多个变量（M/Z蛋白质质谱峰）变化对两样本的分类价值，确定最佳的筛选模型，即诊断模型。
2 结果 2.1 唾液蛋白质谱分析
本研究所有唾液蛋白指纹图谱数据经聚类后共得到稳定表达的蛋白质峰225个。M/Z位于2 000～20 000的波峰有183个，其中有29个蛋白质峰在2组之间表达量差异有统计学意义（P<0.01），11个蛋白质峰在痰瘀互结组中高表达，18个蛋白质峰在肝郁气滞组中高表达。其中P值最小的15个代表性的蛋白质峰见表1。
2.2 诊断模型的建立
经Biomarker Pattern Software5.0.2软件分析后，从上述差异蛋白质峰中选出M/Z为3 809.85、3 110.04、4 970.80的3个蛋白质峰构建决策树分类诊断模型。M/Z 3 809.85、3 110.04、4 970.80在肝郁气滞组表达量均显著增高（见表1）。
此模型分出4个终结点，训练组23例痰瘀互结型甲状腺癌全部被准确诊断，26例肝郁气滞型有24例模型被准确诊断，训练组判别总准确率为95.9%（47/49），灵敏度为92.3% （24/26），特异性为100%（23/23），Youden指数为0.923。交叉验证（测试组）总准确率为85.7%（42/49），灵敏度为84.6% （22/26），特异性为86.9%（20/23），Youden指数为0.715，进一步计算该模型的ROC曲线下面积为0.967，提示该模型具有较好的诊断价值。
3 讨论
“证”是中医的一个特有的概念，对证的研究一直是中医现代化研究的重点。但由于多数实验指标缺乏特异性，因此很难用单一指标来作定性、定量、定位的说明，也难以反映中医证候的整体性和复杂性[4]。近些年开始从基因组学和蛋白质组学角度研究“证”实质，尤其是将蛋白质组学引入中医“证”的实质研究受到普遍重视。
人类基因组计划（HGP）全基因组测序的完成，标志着后基因时代的到来，蛋白质组学研究也有了飞快的发展。SELDI-TOF-MS技术提供了一个高通量和高灵敏度的蛋白质检测平台，目前已在医学的多个领域显示出广阔的应用前景。卢氏等[5]利用SELDI-TOF-MS技术检测甲状腺癌血清蛋白质组图谱，筛选特异的蛋白质标记物，结果区分甲状腺癌和正常人的诊断模型交叉检验敏感性为87.5%，特异性为80.0%，认为此技术检测甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱是早期诊断甲状腺癌的一种特异性强、敏感性高的新方法。王氏等[6]使用SELDI-TOF-MS检测乳头状甲状腺癌与正常人血清蛋白质指纹图谱，鉴定出的载脂蛋白C-Ⅰ、载脂蛋白C-Ⅲ、α-珠蛋白和β- 珠蛋白在乳头状甲状腺癌的诊断中具有一定的价值和广泛的应用前景。
唾液，中医学称之为“金津玉液”，是滋润濡养、化生血液、调节阴阳的重要物质。现代医学把口腔中的唾液称为全唾液，是口腔环境中最重要的成分。唾液中含有一系列具有重要生物学功能的蛋白质和多肽，血清中的很多组分在唾液中也有一定的反映。同时唾液取材方便、低成本性、安全性等优点，以及唾液与血清水平之间的联系使得唾液检测正在成为一种重要的诊断方法[7]。传统的生物化学方法只能研究唾液中少数蛋白质。随着后基因时代的到来，对于唾液蛋白质进行大规模研究即唾液蛋白质组学的研究，虽然才刚刚起步，却展现出巨大的优势及生命力[8]。Ryu等[9]采用SELDI-TOF-MS分析了41例干燥综合征患者和20例健康对照人群的唾液样本，发现疾病组相对分子质量为11.8、12.0、14.3、80.6、83.7 kDa的蛋白质较健康组显著增加。Wu等[10]在国内率先开展了胃溃疡、慢性胃炎、胃癌的病证结合唾液蛋白质组比较研究，首次发现了多种特异唾液蛋白，并初步建立了胃癌的唾液蛋白质组诊断模型。Raymond等[11-12]使用SELDI-TOF-MS检测全唾液的蛋白质组分，结果显示绝大多数的蛋白质峰集中于相对低分子量区域，同时，通过对阴离子、阳离子、亲水性等不同类型的蛋白质芯片比较分析，发现每种芯片都能捕获唾液中的蛋白质，可根据检测的唾液蛋白质分子量选取合适的芯片。本研究也成功地建立了甲状腺癌中医辨证分型的唾液诊断模型，检测出蛋白质峰集中在2 000～15 000 Da相对低分子量的区域。
本研究率先应用SELDI-TOF-MS技术检测甲状腺癌不同证型的唾液蛋白表达指纹图谱，筛选出组间有明显差异的29个蛋白质峰，选取M/Z 3 809.85、3 110.04、4 970.80建立诊断模型。交叉验证（测试组）总准确率为85.7%（42/49），灵敏度86.9%（20/23），特异性84.6%（22/26）。Youden指数为0.715，进一步计算该模型的ROC曲线下面积为0.967，提示该模型具有较好的诊断价值，其敏感性、特异性均达到了较高水平。初步建立了甲状腺癌唾液蛋白质指纹图谱辨证模式，为甲状腺癌的中医证候实质在蛋白质组学水平上提供了特异性指标和物质基础。但本研究只选用了临床常见的2种证型进行初步探讨，且样本量较小，因此，该模型需进一步大样本验证，并进一步研究多个证型间的唾液蛋白表达差异。
参考文献：
[1] 石臣磊，秦华东.甲状腺癌与超声探测甲状腺钙化研究的新进展[J].中国肿瘤临床，2008，35（18）：1073-1075.
[2] 胡学军，蔡光先，刘柏炎，等.蛋白质组学在中医“证”实质研究中的应用[J].中华中医药杂志，2008，23（2）：87-90.
[3] 国家中医药管理局.中医病证诊断疗效标准[S].南京：南京大学出版社，1994：42-43.
[4] 刘喜平.蛋白质组学与中医方正研究思考[J].中医杂志，2004，45（4）：247-248.
[5] 卢秀波，王利，王家祥，等.血清蛋白指纹图谱在甲状腺癌诊断中的应用[J].中华实验外科杂志，2006，23（6）：703-705. [6] 王家祥，董瑞，刘秋亮，等.乳头状甲状腺癌患者血清中特异性标志物的检测与鉴定[J].中华肿瘤杂志，2009，31（4）：265-268.
[7] 刘炜，平飞云.表面加强激光解析电离-飞行时间-质谱技术及其在唾液检测中的研究发展[J].口腔医学，2008，28（10）：554-557.
[8] 姜静，王松灵.唾液蛋白质组学研究进展[J].北京口腔医学，2007， 15（4）：233-235.
[9] Ryu OH， Atkinson JC， Hoehn GT， et al. Identification of parotid salivary biomarkers in Sjogren's syndrome by surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry and two-dimensional difference gel electrophoresis[J]. Rheumatology （Oxford），2006，45（9）：1077-1086.
[10] Wu ZZ， Wang JG， Zhang XL. Diagnostic model of saliva protein finger print analysis of patients with gastric cancer[J]. World J Gastroenterol，2009，15（7）：865-870.
[11] Raymond SP， Arnoud LF， Jolan DG， et al. SELDI-TOF-MS of saliva methodology and pre-treatment effects[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，847（1）：45-53.
[12] Raymond SP， Arnoud LF， Jolan DG， et al. Salivary protein/ peptide profiling with SELDI-TOF-MS[J]. Annals of the New York Academy of Sciences，2007，1098：498-503.
（收稿日期：2012-11-28，编辑：陈静）