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【摘要】 目的 扩增人幽门螺杆菌（Hp）热休克蛋白A(HspA)编码基因并构建其重组表达载体，进行核苷酸序列分析，并在E.coli BL21中表达，为疫苗的开发奠定了基础。
方法 利用PCR技术从Hp基因组DNA中扩增热休克蛋白A（HspA）基因片段，目的基因经SacⅠ和XhoⅠ双酶切、纯化后，插入pET32a(+)载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21并表达。结果 经PCR、酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp HspA编码基因，与GenBank报道的相比较，核酸同源性达98%。经SDS-PAGE分析，表达的融合蛋白分子量约为33 KD，其中目的蛋白的分子量约为13 KD。结论 成功地克隆并表达了Hp HspA编码基因，为HspA蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。
【关键词】 幽门螺杆菌；热休克蛋白A；重组载体；基因表达
文章编号：1003-1383(2007)06-0666-03中图分类号：R 392-33文献标识码：A
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是上消化道疾病的主要致病菌，在人群中的感染率极高，我国普通人群的感染率为50%～80%，每年新增感染人数近千万［1］。Hp不仅是导致慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌、胃黏膜相关性淋巴组织(MALT)淋巴瘤等胃部疾病的主要致病细菌，而且与肠道外疾病的发生也有显著的作用，故已被世界卫生组织国际癌症研究机构列入第一类致癌原［2~4］。根据Hp的感染，临床上多采用复合抗生素疗法，虽然可以达到一定的效果，但却存在再次感染、诱导耐药菌株流行、药物副作用和费用较高等问题，且不能达到预防Hp感染的目的。因此，发展Hp疫苗是预防Hp感染最有效、最有前景的方法。Hp的致病性包括它的动力、黏附力、尿素酶、磷脂酶A、热休克蛋白和毒素等，其中HspA为所有的Hp共同的抗原成分，可刺激机体产生保护性免疫反应。本研究采用基因克隆技术，构建了含HspA基因的重组质粒，并在E.coli中进行表达,为Hp疫苗的研制奠定了基础。
材料和方法
1.材料 ①菌株和质粒：标准Hp菌株11637由本校微生物学教研室提供；DH5α、BL21菌株和pET32a(+)载体为本实验室保存。②主要试剂：PrimeSTAR聚合酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶（SacⅠ和XhoⅠ）、DNA Marker均为TaKaRa公司产品。细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒均为上海华舜生物工程有限公司产品。③引物设计：通过GenBank查询，应用Primer 5.0设计 Hp HspA编码基因的引物P1和P2，P1的序列为5’GCCGAGCTC-ATGAAGTTTCAACCATTAGG3’，P2的序列为: 5’CCGCTCGAGGTGTTTTTTGTGATCATGAC-3’。P1引物中引入了SacⅠ酶切位点，P2引物中引入XhoⅠ酶切位点。
2.方法
(1)Hp染色体DNA的提取 将Hp标准菌株经布氏肉汤培养液进行培养增菌后，取增菌后的菌液按照DNA提取试剂盒说明进行染色体DNA的提取。
(2)HspA基因的扩增 在50 μl反应体系中，分别加入dNTP 4 μl，基因组DNA（作为模板）3 μl及浓度各为20μmol/L的P1和P2引物各0.5μl，以及PrimeSTAR聚合酶0.5 μl，按照下列条件进行PCR扩增，即98℃变性2 min，然后98℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共32个循环，最后一个循环结束后再72℃延伸2 min。所获PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，同时进行20 g/L琼脂糖凝胶回收。
(3)重组载体的构建 将纯化的PCR产物和载体pET32a(+)，分别以SacⅠ和XhoⅠ双酶切，并用PCR纯化试剂盒进行纯化。将酶切纯化的目的基因和pET32a(+)按5∶1（摩尔数）比例，在16℃条件下连接过夜。将10 μl连接产物加入一支感受态细胞中混悬，依次冰浴30 min、42℃水浴90 s、冰浴5 min。最后再在连接产物内加入900 μl LB培养液，于37℃复苏1 h后离心，弃去上清，余少许培养液与沉淀混匀后接种于LB+氨苄青霉素100 mg/L的平皿上，放37℃孵箱过夜。
(4)重组载体的鉴定 ①PCR鉴定：于次日在平皿上分别挑取单个菌落，以细菌本身为模板进行PCR，反应条件为：94℃变性10 min，然后94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32个循环，最后再72℃延伸2 min。所获PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳。
②双酶切鉴定基因测序分析：将经菌落PCR初筛为阳性的重组菌接种于5 ml LB+氨苄青霉素100 mg/L培养液中，于37℃以250 r/min培养12 h后，提取质粒进行SacⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，同时将含阳性重组质粒的细菌克隆，送上海英骏生物技术有限公司对插入片段进行序列测定，测序结果与预期一致的重组质粒命名为pET32a(+)/HspA。
(5)重组载体pET32a(+)/HspA在E.coli中的表达 分别将重组载体及载体pET32a(+)转化E.coli BL21感受态细胞，随后挑选含重组载体的单个菌落接种于LB+氨苄青霉素100 mg/L中，于37℃培养A600=0.4～0.6时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，诱导表达3 h，以10 000 r/min离心2 min。收集菌体，加入等体积蛋白上样缓冲液，煮沸5 min，进行SDSPAGE。
结果
1.热休克蛋白A（HspA）编码基因的扩增 以Hp基因组DNA为模板进行PCR扩增，所获PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增产物与实际HspA编码基因大小相符。
2.重组载体的鉴定 以含重组载体的DH5α菌为模板，按照上述PCR扩增条件进行扩增，所获PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳分析（图1）。结果显示：以含重组载体的DH5α菌为模板均能扩增出1条约为357 bp的条带，与实验设计相一致。
3.HspA基因片段的序列分析 将重组载体以T7为引物进行序列分析（上海英骏生物技术有限公司），并采用电脑DNA分析辅助软件，对所测定的DNA序列进行同源性分析。结果发现，插入的目的片段为HspA基因，与GenBank 上公布的HspA核酸序列相比同源性为98%左右。
4.表达产物的SDSPAGE分析 经IPTG诱导后，含重组载体的菌体蛋白可见Mr为33 KD的融合蛋白，含pET32a(+)的菌体蛋白可见Mr约为20 KD的蛋白（图2）。
3. 经IPTG诱导后含pET32a(+)载体的菌体蛋白；
4. 未经IPTG诱导含pET32a(+)载体的菌体蛋白；5. 阴性对照
讨论
热休克蛋白(heat shock protein, Hsp)又称应激蛋白（stress protein, SP），是生物细胞在某些环境因素或多种应激条件下，诱导合成或合成增加的一类进化上高度保守的应激蛋白质［5］。Hp的HspA是Hp共有的抗原成分，在Hp的致病机制中起着重要的角色，它可介导免疫调节，触发胃上皮细胞的自身免疫反应，在胃黏膜慢性病变的发展和持续中充当启动因子，介导病原与宿主的识别与粘附。另外，由于HspA蛋白序列在不同Hp菌株间高度保守，因此将其单独使用或与其他抗原联用，均可激发机体产生保护免疫，是Hp疫苗的理想组分。所以认为，以热休克蛋白为基础的（核酸DNA，或蛋白质）疫苗不失为一种有效的Hp疫苗。
我们成功地将Hp HspA编码基因进行了克隆，对所构建的重组载体利用重组菌作为模板进行PCR来鉴定，对于PCR阳性的重组菌再进行质粒提取的酶切鉴定和序列分析，提高了重组结果鉴定的效率及准确性。最终经序列分析结果显示HspA基因全长为357 bp，与GenBank 上公布的hspA核酸序列相比同源性为98%左右。
Hp HspA编码基因编码118个氨基酸残基，相对分子质量为13 KD，由于分子量较小，故我们采用原核表达载体pET32a(+)，其主要特点是，除能够编码6个组氨酸残基外，还带有可编码硫氧还蛋白的TrxA基因。外源基因经多克隆位点插入后，可与TrxA基因一起融合表达。融合表达不仅提高了表达产物的稳定性，而且由于相对分子质量增大，SDSPAGE更容易分析鉴定。从SDSPAGE的结果表明，含重组载体的菌体蛋白可见Mr为33 KD的融合蛋白，即硫氧还蛋白HspA的分子量约为33 KD，而含pET32a(+)的菌体蛋白可见Mr约为20 KD的蛋白，与硫氧还蛋白的分子量相符。另外，由于原核表达载体pET32a(+)的6个组氨酸残基可与Ni+NTA琼脂糖树脂中Ni2+结合，从而利于对表达产物进行纯化。而外源蛋白与硫氧还蛋白之间具有肠激酶和凝血酶识别位点，从而也方便了外源蛋白与硫氧还蛋白的分离。
在本研究中，我们成功地克隆了Hp HspA编码基因，构建了重组载体并进行了表达，为今后制备安全、高效的疫苗，以及制备ELISA等快速诊断试剂盒提供了基础。
参考文献
［1］Pounder RE, Ng D. The prevalence of Helicobacter phlori infection in different countrie［J］. Aliment Pharmacol Ther, 1995, 9(Suppl.2):33-39.
［2］Suganuma M, Kurusu M, Okabe S, et al. Helicpbacter pylori membrane protein 1: a new carcinogenic factor of Helicobacter pylori［J］. Cancer Res, 2001, 61:6356.
［3］Loughlin MF. Novel therapeutic targets in Helicobacter pylori［J］. Expert Opin Ther Targets 2003,7:725-735.
［4］Lamarque D, M Peek R Jr. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection［J］. Helicobacter 2003,8(Suppl 1):21-30.
［5］Ning XX, Wu KC, Shi YQ, et al. Construction and expression of gastric cancer MG7 mimic epitopic fused to heat shock protein 70［J］. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2001,9:892-896.
(收稿日期：2007-08-08 修回日期：2007-10-17）
(编辑：梁明佩)
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
方法 利用PCR技术从Hp基因组DNA中扩增热休克蛋白A（HspA）基因片段，目的基因经SacⅠ和XhoⅠ双酶切、纯化后，插入pET32a(+)载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21并表达。结果 经PCR、酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp HspA编码基因，与GenBank报道的相比较，核酸同源性达98%。经SDS-PAGE分析，表达的融合蛋白分子量约为33 KD，其中目的蛋白的分子量约为13 KD。结论 成功地克隆并表达了Hp HspA编码基因，为HspA蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。
【关键词】 幽门螺杆菌；热休克蛋白A；重组载体；基因表达
文章编号：1003-1383(2007)06-0666-03中图分类号：R 392-33文献标识码：A
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是上消化道疾病的主要致病菌，在人群中的感染率极高，我国普通人群的感染率为50%～80%，每年新增感染人数近千万［1］。Hp不仅是导致慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌、胃黏膜相关性淋巴组织(MALT)淋巴瘤等胃部疾病的主要致病细菌，而且与肠道外疾病的发生也有显著的作用，故已被世界卫生组织国际癌症研究机构列入第一类致癌原［2~4］。根据Hp的感染，临床上多采用复合抗生素疗法，虽然可以达到一定的效果，但却存在再次感染、诱导耐药菌株流行、药物副作用和费用较高等问题，且不能达到预防Hp感染的目的。因此，发展Hp疫苗是预防Hp感染最有效、最有前景的方法。Hp的致病性包括它的动力、黏附力、尿素酶、磷脂酶A、热休克蛋白和毒素等，其中HspA为所有的Hp共同的抗原成分，可刺激机体产生保护性免疫反应。本研究采用基因克隆技术，构建了含HspA基因的重组质粒，并在E.coli中进行表达,为Hp疫苗的研制奠定了基础。
材料和方法
1.材料 ①菌株和质粒：标准Hp菌株11637由本校微生物学教研室提供；DH5α、BL21菌株和pET32a(+)载体为本实验室保存。②主要试剂：PrimeSTAR聚合酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶（SacⅠ和XhoⅠ）、DNA Marker均为TaKaRa公司产品。细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒均为上海华舜生物工程有限公司产品。③引物设计：通过GenBank查询，应用Primer 5.0设计 Hp HspA编码基因的引物P1和P2，P1的序列为5’GCCGAGCTC-ATGAAGTTTCAACCATTAGG3’，P2的序列为: 5’CCGCTCGAGGTGTTTTTTGTGATCATGAC-3’。P1引物中引入了SacⅠ酶切位点，P2引物中引入XhoⅠ酶切位点。
2.方法
(1)Hp染色体DNA的提取 将Hp标准菌株经布氏肉汤培养液进行培养增菌后，取增菌后的菌液按照DNA提取试剂盒说明进行染色体DNA的提取。
(2)HspA基因的扩增 在50 μl反应体系中，分别加入dNTP 4 μl，基因组DNA（作为模板）3 μl及浓度各为20μmol/L的P1和P2引物各0.5μl，以及PrimeSTAR聚合酶0.5 μl，按照下列条件进行PCR扩增，即98℃变性2 min，然后98℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共32个循环，最后一个循环结束后再72℃延伸2 min。所获PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，同时进行20 g/L琼脂糖凝胶回收。
(3)重组载体的构建 将纯化的PCR产物和载体pET32a(+)，分别以SacⅠ和XhoⅠ双酶切，并用PCR纯化试剂盒进行纯化。将酶切纯化的目的基因和pET32a(+)按5∶1（摩尔数）比例，在16℃条件下连接过夜。将10 μl连接产物加入一支感受态细胞中混悬，依次冰浴30 min、42℃水浴90 s、冰浴5 min。最后再在连接产物内加入900 μl LB培养液，于37℃复苏1 h后离心，弃去上清，余少许培养液与沉淀混匀后接种于LB+氨苄青霉素100 mg/L的平皿上，放37℃孵箱过夜。
(4)重组载体的鉴定 ①PCR鉴定：于次日在平皿上分别挑取单个菌落，以细菌本身为模板进行PCR，反应条件为：94℃变性10 min，然后94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32个循环，最后再72℃延伸2 min。所获PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳。
②双酶切鉴定基因测序分析：将经菌落PCR初筛为阳性的重组菌接种于5 ml LB+氨苄青霉素100 mg/L培养液中，于37℃以250 r/min培养12 h后，提取质粒进行SacⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，同时将含阳性重组质粒的细菌克隆，送上海英骏生物技术有限公司对插入片段进行序列测定，测序结果与预期一致的重组质粒命名为pET32a(+)/HspA。
(5)重组载体pET32a(+)/HspA在E.coli中的表达 分别将重组载体及载体pET32a(+)转化E.coli BL21感受态细胞，随后挑选含重组载体的单个菌落接种于LB+氨苄青霉素100 mg/L中，于37℃培养A600=0.4～0.6时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，诱导表达3 h，以10 000 r/min离心2 min。收集菌体，加入等体积蛋白上样缓冲液，煮沸5 min，进行SDSPAGE。
结果
1.热休克蛋白A（HspA）编码基因的扩增 以Hp基因组DNA为模板进行PCR扩增，所获PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增产物与实际HspA编码基因大小相符。
2.重组载体的鉴定 以含重组载体的DH5α菌为模板，按照上述PCR扩增条件进行扩增，所获PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳分析（图1）。结果显示：以含重组载体的DH5α菌为模板均能扩增出1条约为357 bp的条带，与实验设计相一致。
3.HspA基因片段的序列分析 将重组载体以T7为引物进行序列分析（上海英骏生物技术有限公司），并采用电脑DNA分析辅助软件，对所测定的DNA序列进行同源性分析。结果发现，插入的目的片段为HspA基因，与GenBank 上公布的HspA核酸序列相比同源性为98%左右。
4.表达产物的SDSPAGE分析 经IPTG诱导后，含重组载体的菌体蛋白可见Mr为33 KD的融合蛋白，含pET32a(+)的菌体蛋白可见Mr约为20 KD的蛋白（图2）。
3. 经IPTG诱导后含pET32a(+)载体的菌体蛋白；
4. 未经IPTG诱导含pET32a(+)载体的菌体蛋白；5. 阴性对照
讨论
热休克蛋白(heat shock protein, Hsp)又称应激蛋白（stress protein, SP），是生物细胞在某些环境因素或多种应激条件下，诱导合成或合成增加的一类进化上高度保守的应激蛋白质［5］。Hp的HspA是Hp共有的抗原成分，在Hp的致病机制中起着重要的角色，它可介导免疫调节，触发胃上皮细胞的自身免疫反应，在胃黏膜慢性病变的发展和持续中充当启动因子，介导病原与宿主的识别与粘附。另外，由于HspA蛋白序列在不同Hp菌株间高度保守，因此将其单独使用或与其他抗原联用，均可激发机体产生保护免疫，是Hp疫苗的理想组分。所以认为，以热休克蛋白为基础的（核酸DNA，或蛋白质）疫苗不失为一种有效的Hp疫苗。
我们成功地将Hp HspA编码基因进行了克隆，对所构建的重组载体利用重组菌作为模板进行PCR来鉴定，对于PCR阳性的重组菌再进行质粒提取的酶切鉴定和序列分析，提高了重组结果鉴定的效率及准确性。最终经序列分析结果显示HspA基因全长为357 bp，与GenBank 上公布的hspA核酸序列相比同源性为98%左右。
Hp HspA编码基因编码118个氨基酸残基，相对分子质量为13 KD，由于分子量较小，故我们采用原核表达载体pET32a(+)，其主要特点是，除能够编码6个组氨酸残基外，还带有可编码硫氧还蛋白的TrxA基因。外源基因经多克隆位点插入后，可与TrxA基因一起融合表达。融合表达不仅提高了表达产物的稳定性，而且由于相对分子质量增大，SDSPAGE更容易分析鉴定。从SDSPAGE的结果表明，含重组载体的菌体蛋白可见Mr为33 KD的融合蛋白，即硫氧还蛋白HspA的分子量约为33 KD，而含pET32a(+)的菌体蛋白可见Mr约为20 KD的蛋白，与硫氧还蛋白的分子量相符。另外，由于原核表达载体pET32a(+)的6个组氨酸残基可与Ni+NTA琼脂糖树脂中Ni2+结合，从而利于对表达产物进行纯化。而外源蛋白与硫氧还蛋白之间具有肠激酶和凝血酶识别位点，从而也方便了外源蛋白与硫氧还蛋白的分离。
在本研究中，我们成功地克隆了Hp HspA编码基因，构建了重组载体并进行了表达，为今后制备安全、高效的疫苗，以及制备ELISA等快速诊断试剂盒提供了基础。
参考文献
［1］Pounder RE, Ng D. The prevalence of Helicobacter phlori infection in different countrie［J］. Aliment Pharmacol Ther, 1995, 9(Suppl.2):33-39.
［2］Suganuma M, Kurusu M, Okabe S, et al. Helicpbacter pylori membrane protein 1: a new carcinogenic factor of Helicobacter pylori［J］. Cancer Res, 2001, 61:6356.
［3］Loughlin MF. Novel therapeutic targets in Helicobacter pylori［J］. Expert Opin Ther Targets 2003,7:725-735.
［4］Lamarque D, M Peek R Jr. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection［J］. Helicobacter 2003,8(Suppl 1):21-30.
［5］Ning XX, Wu KC, Shi YQ, et al. Construction and expression of gastric cancer MG7 mimic epitopic fused to heat shock protein 70［J］. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2001,9:892-896.
(收稿日期：2007-08-08 修回日期：2007-10-17）
(编辑：梁明佩)
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。