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【摘 要】依据基因工程的实际特点，分别对获得目的DNA的反向PCR、反转录PCR和锚定PCR等几个常用的基因克隆方法进行了对应的介绍和分析。
【关键词】反向PCR;反转录PCR;锚定PCR;基因克隆;方法
据实践可知，实施基因工程的程序，首先是要取得目的DNA的片段，这是前期必要的步骤。因此，怎么去圆满地完成这一过程，就成为了基因工程中的首要因素。单从目的DNA的提供方式而言，其只有分离天然动植物DNA及人造DNA两种方式。而就获得目的基因的方法而言，其基本上有PCR、化学合成、cDNA和设置基因文库的方式进行优选等几种类型。
1.何谓基因工程的PCR
在一九八五年，美国相关公司的数名专家首先设置了快速复制增加特性DNA片段的工艺技术，具体的化学名称叫做聚合酶链式反应，其英文缩写即为PCR。基因聚合酶起初是在一九五五年被发现的，而富含较高实用价值的聚合酶是在七十年代初期才被发现的。然而，因为此聚合酶不具有耐高温性能，其在高温的情况下就会发生较大的性能改变，所以，不适合高温的聚合酶链式反应。现时被广为使用的一种聚合酶，是在一九七六年取自于温泉水里的一种细菌。它是具有相当耐高温性能且极为完好的一种酶。初始的PCR概念基本是指基因的修复和复制，它具有单一和短暂的性能缺陷。从一九八三年开始，PE公司就率先应用了新的PCR。
因为PCR属于一类体外快速增加指定DNA或其序列的功能系统，所以还可以取名为DNA的体外扩增法。在当今PCR工艺已经是人类获取外部基因的一个最佳手段，只要掌握了目的DNA的核苷酸排序，人们即能够拟定出一段引物，采取PCR工艺，在试管内设置反应过程，经历若干小时以后，即可以把相当小量的目的DNA或指定的基因片段增加数十万倍。甚至达到百万倍。
2.PCR工艺过程机理
由于PCR工艺是一项体外复制特定基因片段的生物技术，所以，其与基因分子的体内复制过程有若干相似的情况，同时也存在着不少的相异地方。细胞里基因的复制过程是首先把双链DNA分解螺旋变成单链DNA。尔后，RNA引物与单链DNA模板结好对，在有四种核苷酸底物的前提下，基因聚合酶与RNA引物的3’端依据碱基互补配对的规则组合成具有互补性的基因链。经过一个复制过程后，单个基因分子变成了双个基因分子。PCR就是代表试管里进行的基因复制经历，其余体内基因复制模式相同，都要具备单链模板、引物、四种核苷酸底物、基因聚合酶，复制后达到相同的效果。其区别就是PCR所使用的引物是单链的基因引物，其聚合酶是属于耐高温性能的。在试管中所作的整个复制过程分三个过程：第一步是变性过程，其为PCR反应的第一阶段，也就是把模板基因放置在九十五摄氏度左右的高温之中，将双链基因转变成单链基因;第二步即为退火过程，也就是把反应温度下调到五十摄氏度左右，促使一队引物先后与变性后的两个模板实施配对;第三步为延伸过程，即把反应温度设置在聚合酶反应的最佳温度七十二摄氏度，尔后，用目的基因做模板合成新的基因链。因为其所用聚合酶的耐高温品质，在每个复制阶段完成后，无需增加任一别的反应组分即能够重新开始下一阶段的复制。
3.PCR方法的基因复制
采用PCR复制DNA片段系基因工程的一项重要手段。
3.1依托反向PCR复制目的基因片段
由基因组依托PCR复制基因片段过程的重要一环是引物的拟定，通常能够依据业已公布的基因排列拟定引物，也可以凭借原有的相关基因序列拟定引物。若要依据cDNA排列拟定引物增加基因数目，拟定引物时，必须顾及到cDNA基因没有内含子，而gDNA存在内含子，拟定引物时，不能够置于外显子的拼接点上。拟定引物时，一般可以在引物的末端设置一个酶切位点，从而促进基因片段与载体的连接。
反向PCR系一类依托原有系列增加其旁侧序列的模式，凭借此方法，能够实施染色体步移。其开始的步骤，是把基因组DNA依靠限制性的内切酶给予切割开来，莎草用的限制酶必须在原有序列中不存在切点，而后再依托连接酶把酶切片段连接起来，与此类产物中，其含有原来序列的环形基因会得到大幅度增加。由此获取原来基因片段的旁侧序列。
3.2 cDNA的制备及cDNA文库的建立
cDNA的制备可以采用RT-PCR方法。亦被称作反转录PCR。其属于一类酶促进制备方法，就是用mDNA做模板，依靠反转录酶的作用，用四种脱氧核甘三磷酸为反应物成分制备DNA，再通过复制以后就可得到双链的基因。
3.3锚定PCR过程及基因的复制
经过RT-PCR过程获取的大规模双链cDNA以后，欲要精选分离出所需的特定目的基因，若不用cDNA文库筛选时，尚可运用锚定PCR的方法将其收获。此种措施的特点，是凭借原已存在的一中特异性的引物来实现，其尤其适合于扩增那些紧掌握一段序列形态的目的基因，比如一端序列已经知道，而另一段序列未知的基因片段，能够依托基因末端转移酶将cDNA第一个末端添上一端多聚dG尾巴，尔后添加一个末端属于多聚dC的特异引物，由此决定了扩增的特性。锚定PCR是研究遗传学及医学的有效方法。
小结
通过上述介绍和分析，我们基本掌握了获取目的基因的来源和几种相当实用的基因克隆方法，这几种很常用的方法，它们都有各自的特性和优点，我们在实际基因工程研究中，还要不断的总结、完善并加以创新，促使其能够更好地为我们人类的遗传、医学等相关行业服务。
【参考文献】
[1]赵焕英，包金风.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2007.16（4）：492-497
[2]董明，宫月华，王兰等.DNA提取的应用与相关技术分析[J].遗传，2003.25（2）：205-207
[3]郭燕霞，刘开会，邱宁等.6种特殊生物检材的DNA提取[J].刑事技术，2002.5：52-53
【作者简介】
于丽丽（1981.12-），籍贯：吉林省梨树县;单位：公主岭实验中学。
（作者单位：公主岭实验中学）
【关键词】反向PCR;反转录PCR;锚定PCR;基因克隆;方法
据实践可知，实施基因工程的程序，首先是要取得目的DNA的片段，这是前期必要的步骤。因此，怎么去圆满地完成这一过程，就成为了基因工程中的首要因素。单从目的DNA的提供方式而言，其只有分离天然动植物DNA及人造DNA两种方式。而就获得目的基因的方法而言，其基本上有PCR、化学合成、cDNA和设置基因文库的方式进行优选等几种类型。
1.何谓基因工程的PCR
在一九八五年，美国相关公司的数名专家首先设置了快速复制增加特性DNA片段的工艺技术，具体的化学名称叫做聚合酶链式反应，其英文缩写即为PCR。基因聚合酶起初是在一九五五年被发现的，而富含较高实用价值的聚合酶是在七十年代初期才被发现的。然而，因为此聚合酶不具有耐高温性能，其在高温的情况下就会发生较大的性能改变，所以，不适合高温的聚合酶链式反应。现时被广为使用的一种聚合酶，是在一九七六年取自于温泉水里的一种细菌。它是具有相当耐高温性能且极为完好的一种酶。初始的PCR概念基本是指基因的修复和复制，它具有单一和短暂的性能缺陷。从一九八三年开始，PE公司就率先应用了新的PCR。
因为PCR属于一类体外快速增加指定DNA或其序列的功能系统，所以还可以取名为DNA的体外扩增法。在当今PCR工艺已经是人类获取外部基因的一个最佳手段，只要掌握了目的DNA的核苷酸排序，人们即能够拟定出一段引物，采取PCR工艺，在试管内设置反应过程，经历若干小时以后，即可以把相当小量的目的DNA或指定的基因片段增加数十万倍。甚至达到百万倍。
2.PCR工艺过程机理
由于PCR工艺是一项体外复制特定基因片段的生物技术，所以，其与基因分子的体内复制过程有若干相似的情况，同时也存在着不少的相异地方。细胞里基因的复制过程是首先把双链DNA分解螺旋变成单链DNA。尔后，RNA引物与单链DNA模板结好对，在有四种核苷酸底物的前提下，基因聚合酶与RNA引物的3’端依据碱基互补配对的规则组合成具有互补性的基因链。经过一个复制过程后，单个基因分子变成了双个基因分子。PCR就是代表试管里进行的基因复制经历，其余体内基因复制模式相同，都要具备单链模板、引物、四种核苷酸底物、基因聚合酶，复制后达到相同的效果。其区别就是PCR所使用的引物是单链的基因引物，其聚合酶是属于耐高温性能的。在试管中所作的整个复制过程分三个过程：第一步是变性过程，其为PCR反应的第一阶段，也就是把模板基因放置在九十五摄氏度左右的高温之中，将双链基因转变成单链基因;第二步即为退火过程，也就是把反应温度下调到五十摄氏度左右，促使一队引物先后与变性后的两个模板实施配对;第三步为延伸过程，即把反应温度设置在聚合酶反应的最佳温度七十二摄氏度，尔后，用目的基因做模板合成新的基因链。因为其所用聚合酶的耐高温品质，在每个复制阶段完成后，无需增加任一别的反应组分即能够重新开始下一阶段的复制。
3.PCR方法的基因复制
采用PCR复制DNA片段系基因工程的一项重要手段。
3.1依托反向PCR复制目的基因片段
由基因组依托PCR复制基因片段过程的重要一环是引物的拟定，通常能够依据业已公布的基因排列拟定引物，也可以凭借原有的相关基因序列拟定引物。若要依据cDNA排列拟定引物增加基因数目，拟定引物时，必须顾及到cDNA基因没有内含子，而gDNA存在内含子，拟定引物时，不能够置于外显子的拼接点上。拟定引物时，一般可以在引物的末端设置一个酶切位点，从而促进基因片段与载体的连接。
反向PCR系一类依托原有系列增加其旁侧序列的模式，凭借此方法，能够实施染色体步移。其开始的步骤，是把基因组DNA依靠限制性的内切酶给予切割开来，莎草用的限制酶必须在原有序列中不存在切点，而后再依托连接酶把酶切片段连接起来，与此类产物中，其含有原来序列的环形基因会得到大幅度增加。由此获取原来基因片段的旁侧序列。
3.2 cDNA的制备及cDNA文库的建立
cDNA的制备可以采用RT-PCR方法。亦被称作反转录PCR。其属于一类酶促进制备方法，就是用mDNA做模板，依靠反转录酶的作用，用四种脱氧核甘三磷酸为反应物成分制备DNA，再通过复制以后就可得到双链的基因。
3.3锚定PCR过程及基因的复制
经过RT-PCR过程获取的大规模双链cDNA以后，欲要精选分离出所需的特定目的基因，若不用cDNA文库筛选时，尚可运用锚定PCR的方法将其收获。此种措施的特点，是凭借原已存在的一中特异性的引物来实现，其尤其适合于扩增那些紧掌握一段序列形态的目的基因，比如一端序列已经知道，而另一段序列未知的基因片段，能够依托基因末端转移酶将cDNA第一个末端添上一端多聚dG尾巴，尔后添加一个末端属于多聚dC的特异引物，由此决定了扩增的特性。锚定PCR是研究遗传学及医学的有效方法。
小结
通过上述介绍和分析，我们基本掌握了获取目的基因的来源和几种相当实用的基因克隆方法，这几种很常用的方法，它们都有各自的特性和优点，我们在实际基因工程研究中，还要不断的总结、完善并加以创新，促使其能够更好地为我们人类的遗传、医学等相关行业服务。
【参考文献】
[1]赵焕英，包金风.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2007.16（4）：492-497
[2]董明，宫月华，王兰等.DNA提取的应用与相关技术分析[J].遗传，2003.25（2）：205-207
[3]郭燕霞，刘开会，邱宁等.6种特殊生物检材的DNA提取[J].刑事技术，2002.5：52-53
【作者简介】
于丽丽（1981.12-），籍贯：吉林省梨树县;单位：公主岭实验中学。
（作者单位：公主岭实验中学）