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摘要：目的 检测慢性乙型肝炎（CHB）患者经恩替卡韦治疗前后血清和外周血单个核细胞（PBMC）中的HBV DNA、cccDNA，探讨其应用价值。方法 选取112例符合条件的CHB患者，给予恩替卡韦治疗（0.5mg/d），采用荧光定量PCR法分别对治疗48周、96周时血清和PBMC中HBV DNA、cccDNA进行检测，应用SPSS19.0对结果进行统计学分析。结果 治疗48周前后相比，血清中HBV DNA由（1.01±0.39）*107降到（1.38±0.22）*105，cccDNA由（3.69±1.02）*106降到（4.37±0.97）*104，血清和PBMC中HBV DNA及cccDNA的转阴率分别为：88.4%、100%、62.5%、100%，二者均具有统计学差异（P<0.01）。结论 恩替卡韦在治疗CHB及抑制病毒复制方面作用显著；cccDNA的含量与HBV DNA的含量密切相关；PBMC与血清中各指标密切相关。
关键词：恩替卡韦；单个核细胞；cccDNA
慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B，CHB）的防治是世界性的公共卫生问题，全世界约有35-40亿人是表面抗原携带者[1-2]，共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的存在及消除困难是CHB难以治愈的原因之一[3]，恩替卡韦作为治疗CHB的一线用药，具有抑制病毒效果好、毒副作用小等优点[4]，本文主要是检测经恩替卡韦治疗前后血清和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中HBV DNA及cccDNA含量，并探讨其在恩替卡韦治疗CHB中的价值。
1资料与方法
1.1 一般资料 2010年—2013年大连市第六人民医院住院患者112例，男72，女40例，年龄38～62岁，平均（48.76±6.66）年，诊断符合2012年《慢性乙型肝炎防治指南》标准[5]，并符合抗病毒药物治疗条件。同时符合以下标准：（1）谷丙转氨酶（ALT）≥正常值2倍；（2）HBsAg、HBeAg、抗-HBcIgG均阳性；（3）HBV DNA≥105IU/ml；（4）排除合并HAV、HIV、HCV及HEV感染；（5）排除由酒精、药物等造成的肝功异常；（6）排除心、肺、肾及肿瘤等疾病。（7）患者及家属均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 外周血单个核细胞的提取 用Ficoll分离液对抗凝血进行单个核细胞分离，洗涤五次，留取末次洗涤液进行HBV DNA及cccDNA检测，排除血清干扰。
1.2.2 HBV DNA及cccDNA的提取 对所选患者治疗48周、96周前后按照乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、乙型肝炎病毒cccDNA定量检测试剂盒（均购于上海复星长征医学科学有限公司）说明书对血清及PBMC中HBV DNA、cccDNA进行提取。
1.2.3 HBV DNA及cccDNA的扩增及检测 分别应用MX3000P及ABI7500荧光定量PCR仪对HBV DNA及cccDNA进行扩增（扩增条件为：HBV DNA：50℃ 2min→94℃ 5min→（94℃10s 60℃45s）循环40次；HBV cccDNA：50℃2min→94℃5min→（94℃30s 60℃90s）循环40次），并记录结果。
1.3 统计学分析
应用SPSS19.0对结果进行统计分析，对计量资料采取t检验，计数资料进行χ2检验，对HBV DNA与cccDNA的量进行相关性分析。
2.结果
2.1治疗48周前后血清中HBV DNA及cccDNA的检测结果（见表1）：
结果显示：表3：治疗48周前后，随着HBV DNA含量的下降，cccDNA的量也随着降低，SPSS19.0对HBV DNA与cccDNA进行相关性分析，相关系数分别为0.598、0.868（P<0.01），说明HBV cccDNA与DNA具有一定相关性，cccDNA可在一定程度上反应DNA水平。表4：通过对不同检测标本同一检测指标进行相关性分析，说明PBMC中HBV DNA、cccDNA与血清中HBV DNA、cccDNA存在相关性，相关系数分别为0.827、0.961（P<0.01），证实PBMC中HBV DNA、cccDNA水平能在一定程度上反应其在血清中的水平，在临床上可对CHB的诊断、治疗提供参考价值。
3.讨论
目前对于CHB的治疗多用抗病毒药物持续抑制HBV DNA的复制，进一步阻止其向肝硬化、肝癌的演变。恩替卡韦是环氧羟碳脱氧鸟嘌呤核苷类似物，继拉米夫定、阿德福韦酯后成为治疗CHB的一线用药，本实验结果显示：治疗48周前后相比，血清中HBV DNA由（1.01±0.39）*107降到（1.38±0.22）*105，cccDNA由（3.69±1.02）*106降到（4.37±0.97）*104，两项指标明显降低；96周时，CHB患者两项指标大部分已转阴，说明随着恩替卡韦治疗时间的延长，CHB患者HBV DNA及cccDNA的含量明显下降，甚至转阴，恩替卡韦明显抑制了病毒的复制。Haqiwara等[6]选取17名HBV C基因型的患者接受恩替卡韦及聚乙二醇α-2b联合治疗48周，随访24周，血清中HBV DNA水平下降及肝组织内cccDNA均有所降低，进一步说明恩替卡韦在治疗CHB方面作用显著。
CHB抗病毒治疗的一大障碍是HBV cccDNA的形成及消除困难。cccDNA是在HBV感染肝细胞过程中形成的，由HBV进入肝细胞后释放的松弛环状DNA（rcDNA）分子在細胞核内转化而来，是HBV复制的重要中间体、前基因组RNA和mRNA的复制模板[7]，国外有研究证实，肝内的cccDNA对急慢性乙型肝炎的抗病毒治疗具有预测价值，Ruan[8]等选取11名急性乙型肝炎和46名慢性乙型肝炎患者进行抗病毒治疗，比较治疗前后肝内cccDNA、总DNA、血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg及ALT，结果显示：接受抗病毒治疗的急慢性乙型肝炎患者即使实现了HBsAg的转阴，肝内的cccDNA仍然持续存在，肝内的cccDNA及总DNA水平对于急慢性乙型肝炎患者接受抗病毒治疗是否成功具有潜在的预测价值，抑制肝内cccDNA的复制可反映HBV在抗病毒治疗时受到有效的免疫控制[9]。早有研究证实在PBMC可检测到cccDNA[10]，本实验通过对治疗前血清和PBMC中HBV DNA、cccDNA进行相关性分析，结果显示：cccDNA水平与DNA水平呈正相关，与国外研究相一致[11]。PBMC与血清中各指标高度相关，可在一定程度上反应血清指标的情况，通过对PBMC中tDNA、cccDNA的水平，可反应表面抗原阴性、阳性患者不同的免疫状态，PBMC中HBV DNA的水平可反应表面抗原阳性患者病毒再活化的风险[12]。在用药期间对cccDNA进行检测，可辅助HBV DNA对用药疗程及停药时机等进行判断。 cccDNA主要存在于肝细胞，外周血中cccDNA大多是肝细胞破裂释放入血的，当恩替卡韦抑制HBV DNA的复制时，肝细胞中cccDNA可作为模板来合成HBV DNA，cccDNA被消耗，也导致外周血中cccDNA的减少，本实验对接受恩替卡韋治疗前后患者PBMC中HBV DNA 及cccDNA进行检测，结果显示治疗前后各指标含量均明显下降甚至转阴，cccDNA转阴率均达100%，但不代表cccDNA被完全清除，检测试剂盒显示HBV cccDNA的检测下限是5*103，低于检测下限者可能由于方法学灵敏度的限制造成假阴性，但由于cccDNA能在一定程度上反映HBV DNA的水平，所以具有一定应用价值，后期研究应完善cccDNA监测的方法学，提高灵敏度及特异性，尽早应用于临床，使其在CHB的诊断、用药治疗、肝移植监测等方面发挥作用。
参考文献：
[1]Zoulim，F.，Hepatitis B virus resistance to antiviral drugs：where are we going？ Liver Int，2011：31：111-116.
[2]European Association For The Study Of The Liver EASL clinical practice guideline：Management of chronic hepatitis B Virus infection.J Hepatol，2012，57：167-185.
[3] Wong DK，Yuen MF，Yuan HJ，et al.Quantitation of covalently closed circular hepatitis B virus DNA in chronic hepatitis B patients.Hepatology，2004，40（9）：727-737.
[4]吕继算，恩替卡韦对慢性乙型肝炎患者外周血T细胞亚群和肝纤维化指标的影响，中国药业，2013，3（22）：10-11.
[5]中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南.2012，40（4）：66-78.
[6]Haqiwara S，Kudo M，Osaki Y，et al.Impact of peginterferon alpha-2b and entecavir hydrate combination therapy on persistent viral suppression in patients with chronic hepatitis B.J Med Virol.2013，85（6）：987-995.
[7]C.Seeger，W.S.Masson.Hepatitis B Virus biology.Microb.Molec.Biol.Rev，2000，64：51-58.
[8]Ruan P，Zhou B，Dai X，et al.Predictive value of intrahepatic hepatitis B virus covalently closed circular DNA and total DNA in patients with acute hepatitis B and patients with chronic hepatitis B receiving anti-viral treatment.Mol Med Rep.2014，9（4）：1135-1141.
[9]Li W，Zhao J，Zou Z，et al.Analysis of hepatitis B virus intrahepatic covalently closed circular DNA and serum viral markers in treatment-native patients with acute and chronic HBV infection.PLoS One，2014，9（2）：1371-1381.
[10]Torri N，Hasegawa K，Joh R，et al.Configuration and replication competence of hepatitis B virus DNA in peripheral blood mononuclear cells from chronic hepatitis B patients and patients who have recovered from acute self-limited hepatitis.Hepatol Res.2003，25（3）：234-243.
[11]Sinqla B，Chakraborti A，Sharma BK，et al.Levels of hepatitis B virus replicative in serum samples of chronic hepatitis B patients.Mol Biol Rep，2014，4，[Epub ahead of print]
[12]Loustaud-Ratti V1，Wagner A，Carrier P，et al.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2013，37（4）：373-383.
关键词：恩替卡韦；单个核细胞；cccDNA
慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B，CHB）的防治是世界性的公共卫生问题，全世界约有35-40亿人是表面抗原携带者[1-2]，共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的存在及消除困难是CHB难以治愈的原因之一[3]，恩替卡韦作为治疗CHB的一线用药，具有抑制病毒效果好、毒副作用小等优点[4]，本文主要是检测经恩替卡韦治疗前后血清和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中HBV DNA及cccDNA含量，并探讨其在恩替卡韦治疗CHB中的价值。
1资料与方法
1.1 一般资料 2010年—2013年大连市第六人民医院住院患者112例，男72，女40例，年龄38～62岁，平均（48.76±6.66）年，诊断符合2012年《慢性乙型肝炎防治指南》标准[5]，并符合抗病毒药物治疗条件。同时符合以下标准：（1）谷丙转氨酶（ALT）≥正常值2倍；（2）HBsAg、HBeAg、抗-HBcIgG均阳性；（3）HBV DNA≥105IU/ml；（4）排除合并HAV、HIV、HCV及HEV感染；（5）排除由酒精、药物等造成的肝功异常；（6）排除心、肺、肾及肿瘤等疾病。（7）患者及家属均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 外周血单个核细胞的提取 用Ficoll分离液对抗凝血进行单个核细胞分离，洗涤五次，留取末次洗涤液进行HBV DNA及cccDNA检测，排除血清干扰。
1.2.2 HBV DNA及cccDNA的提取 对所选患者治疗48周、96周前后按照乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、乙型肝炎病毒cccDNA定量检测试剂盒（均购于上海复星长征医学科学有限公司）说明书对血清及PBMC中HBV DNA、cccDNA进行提取。
1.2.3 HBV DNA及cccDNA的扩增及检测 分别应用MX3000P及ABI7500荧光定量PCR仪对HBV DNA及cccDNA进行扩增（扩增条件为：HBV DNA：50℃ 2min→94℃ 5min→（94℃10s 60℃45s）循环40次；HBV cccDNA：50℃2min→94℃5min→（94℃30s 60℃90s）循环40次），并记录结果。
1.3 统计学分析
应用SPSS19.0对结果进行统计分析，对计量资料采取t检验，计数资料进行χ2检验，对HBV DNA与cccDNA的量进行相关性分析。
2.结果
2.1治疗48周前后血清中HBV DNA及cccDNA的检测结果（见表1）：
结果显示：表3：治疗48周前后，随着HBV DNA含量的下降，cccDNA的量也随着降低，SPSS19.0对HBV DNA与cccDNA进行相关性分析，相关系数分别为0.598、0.868（P<0.01），说明HBV cccDNA与DNA具有一定相关性，cccDNA可在一定程度上反应DNA水平。表4：通过对不同检测标本同一检测指标进行相关性分析，说明PBMC中HBV DNA、cccDNA与血清中HBV DNA、cccDNA存在相关性，相关系数分别为0.827、0.961（P<0.01），证实PBMC中HBV DNA、cccDNA水平能在一定程度上反应其在血清中的水平，在临床上可对CHB的诊断、治疗提供参考价值。
3.讨论
目前对于CHB的治疗多用抗病毒药物持续抑制HBV DNA的复制，进一步阻止其向肝硬化、肝癌的演变。恩替卡韦是环氧羟碳脱氧鸟嘌呤核苷类似物，继拉米夫定、阿德福韦酯后成为治疗CHB的一线用药，本实验结果显示：治疗48周前后相比，血清中HBV DNA由（1.01±0.39）*107降到（1.38±0.22）*105，cccDNA由（3.69±1.02）*106降到（4.37±0.97）*104，两项指标明显降低；96周时，CHB患者两项指标大部分已转阴，说明随着恩替卡韦治疗时间的延长，CHB患者HBV DNA及cccDNA的含量明显下降，甚至转阴，恩替卡韦明显抑制了病毒的复制。Haqiwara等[6]选取17名HBV C基因型的患者接受恩替卡韦及聚乙二醇α-2b联合治疗48周，随访24周，血清中HBV DNA水平下降及肝组织内cccDNA均有所降低，进一步说明恩替卡韦在治疗CHB方面作用显著。
CHB抗病毒治疗的一大障碍是HBV cccDNA的形成及消除困难。cccDNA是在HBV感染肝细胞过程中形成的，由HBV进入肝细胞后释放的松弛环状DNA（rcDNA）分子在細胞核内转化而来，是HBV复制的重要中间体、前基因组RNA和mRNA的复制模板[7]，国外有研究证实，肝内的cccDNA对急慢性乙型肝炎的抗病毒治疗具有预测价值，Ruan[8]等选取11名急性乙型肝炎和46名慢性乙型肝炎患者进行抗病毒治疗，比较治疗前后肝内cccDNA、总DNA、血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg及ALT，结果显示：接受抗病毒治疗的急慢性乙型肝炎患者即使实现了HBsAg的转阴，肝内的cccDNA仍然持续存在，肝内的cccDNA及总DNA水平对于急慢性乙型肝炎患者接受抗病毒治疗是否成功具有潜在的预测价值，抑制肝内cccDNA的复制可反映HBV在抗病毒治疗时受到有效的免疫控制[9]。早有研究证实在PBMC可检测到cccDNA[10]，本实验通过对治疗前血清和PBMC中HBV DNA、cccDNA进行相关性分析，结果显示：cccDNA水平与DNA水平呈正相关，与国外研究相一致[11]。PBMC与血清中各指标高度相关，可在一定程度上反应血清指标的情况，通过对PBMC中tDNA、cccDNA的水平，可反应表面抗原阴性、阳性患者不同的免疫状态，PBMC中HBV DNA的水平可反应表面抗原阳性患者病毒再活化的风险[12]。在用药期间对cccDNA进行检测，可辅助HBV DNA对用药疗程及停药时机等进行判断。 cccDNA主要存在于肝细胞，外周血中cccDNA大多是肝细胞破裂释放入血的，当恩替卡韦抑制HBV DNA的复制时，肝细胞中cccDNA可作为模板来合成HBV DNA，cccDNA被消耗，也导致外周血中cccDNA的减少，本实验对接受恩替卡韋治疗前后患者PBMC中HBV DNA 及cccDNA进行检测，结果显示治疗前后各指标含量均明显下降甚至转阴，cccDNA转阴率均达100%，但不代表cccDNA被完全清除，检测试剂盒显示HBV cccDNA的检测下限是5*103，低于检测下限者可能由于方法学灵敏度的限制造成假阴性，但由于cccDNA能在一定程度上反映HBV DNA的水平，所以具有一定应用价值，后期研究应完善cccDNA监测的方法学，提高灵敏度及特异性，尽早应用于临床，使其在CHB的诊断、用药治疗、肝移植监测等方面发挥作用。
参考文献：
[1]Zoulim，F.，Hepatitis B virus resistance to antiviral drugs：where are we going？ Liver Int，2011：31：111-116.
[2]European Association For The Study Of The Liver EASL clinical practice guideline：Management of chronic hepatitis B Virus infection.J Hepatol，2012，57：167-185.
[3] Wong DK，Yuen MF，Yuan HJ，et al.Quantitation of covalently closed circular hepatitis B virus DNA in chronic hepatitis B patients.Hepatology，2004，40（9）：727-737.
[4]吕继算，恩替卡韦对慢性乙型肝炎患者外周血T细胞亚群和肝纤维化指标的影响，中国药业，2013，3（22）：10-11.
[5]中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南.2012，40（4）：66-78.
[6]Haqiwara S，Kudo M，Osaki Y，et al.Impact of peginterferon alpha-2b and entecavir hydrate combination therapy on persistent viral suppression in patients with chronic hepatitis B.J Med Virol.2013，85（6）：987-995.
[7]C.Seeger，W.S.Masson.Hepatitis B Virus biology.Microb.Molec.Biol.Rev，2000，64：51-58.
[8]Ruan P，Zhou B，Dai X，et al.Predictive value of intrahepatic hepatitis B virus covalently closed circular DNA and total DNA in patients with acute hepatitis B and patients with chronic hepatitis B receiving anti-viral treatment.Mol Med Rep.2014，9（4）：1135-1141.
[9]Li W，Zhao J，Zou Z，et al.Analysis of hepatitis B virus intrahepatic covalently closed circular DNA and serum viral markers in treatment-native patients with acute and chronic HBV infection.PLoS One，2014，9（2）：1371-1381.
[10]Torri N，Hasegawa K，Joh R，et al.Configuration and replication competence of hepatitis B virus DNA in peripheral blood mononuclear cells from chronic hepatitis B patients and patients who have recovered from acute self-limited hepatitis.Hepatol Res.2003，25（3）：234-243.
[11]Sinqla B，Chakraborti A，Sharma BK，et al.Levels of hepatitis B virus replicative in serum samples of chronic hepatitis B patients.Mol Biol Rep，2014，4，[Epub ahead of print]
[12]Loustaud-Ratti V1，Wagner A，Carrier P，et al.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2013，37（4）：373-383.