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摘要 [目的]以煙草根结线虫感病烟株根际土壤为研究对象，探寻健康与感病烟株根际土壤7种酚酸物质 （对羟基苯甲酸、丁香酸、阿魏酸、4-香豆酸、肉桂酸、香草酸、阔马酸） 变化特征，为有效防控该病提供理论依据。[方法]采用 HPLC 技术分别检测感病和健康烟株根际土壤中酚酸物质含量，分析感病与健康烟株根际土壤酚酸物质的含量差异。[结果]健康及根结线虫感病烟株根际土壤中均检测出6种酚酸类物质，除4-香豆酸变化不明显外，感病烟株根际土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸和肉桂酸含量均较健康烟株有所增加。其中玉溪试验区感病根际土壤中对羟基苯甲酸和丁香酸增加量达31.0%和35.0%，差异显著;同时，阿魏酸、肉桂酸、香草酸也呈现累积效应，分别较健康根际土壤增长了14.7%、18.0%及6.7%;同样，在九乡试验区土壤样品中香草酸含量变化较大，其感病烟株根际土壤中的含量较健康烟株增加38%，而对羟基苯甲酸含量变化较小，仅增长2.5%，同时丁香酸、阿魏酸及肉桂酸含量分别较健康土壤增长17%、5.4% 及21.5%。[结论]感病烟株根际土壤酚酸类物质含量及潜在功能与健康烟株显著不同，土壤微生态环境中的生物因子和非生物因子互作，对根际土壤酚酸类物质的变化特征塑造起重要作用;同时不同区域的自然和管理条件差异，及植物对不同生态位的选择和适应可能会导致根系分泌物组成和含量发生较大改变。
关键词 烟草;植烟土壤;根结线虫;酚酸类物质
中图分类号 S-435.72 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）13-0153-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.037
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on Changes of Phenolic Acids in Rhizosphere Soil of Tobacco Root Knot Nematode Infected Tobacco Plants
WANG Qi yu1，DENG Xiao peng2，ZHANG Liu chen3 et al
（1.Yunnan Urban Agricultural Engineering & Technological Research Center，College of Agronomy，Kunming University，Kunming， Yunnan 650214;2.Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences，Kunming，Yunnan 650201;3.China National Tobacco Corporation Yunnan Company，Kunming，Yunnan 650011）
Abstract [Objective]This article takes the rhizosphere soil of tobacco root knot nematode susceptible tobacco plants as the research object to explore 7 phenols in the rhizosphere soil of healthy and susceptible tobacco plants.The change characteristics of acid substances （p hydroxybenzoic acid，syringic acid，ferulic acid，4 coumaric acid，cinnamic acid，vanillic acid，colmaric acid） provide a theoretical basis for effective prevention and control of the disease.[Method]HPLC technology was used to detect the phenolic acid content in the rhizosphere soil of susceptible and healthy tobacco plants respectively，and the difference of phenolic acid content in the rhizosphere soil of susceptible and healthy tobacco plants was analyzed.[Result]6 phenolic acids were detected in the rhizosphere soil of healthy and root knot nematode susceptible tobacco plants.Except for 4 coumaric acid，the rhizosphere soil of susceptible tobacco plants had no obvious changes.The contents of benzoic acid，vanillic acid，syringic acid，ferulic acid and cinnamic acid were all increased compared with healthy tobacco plants.Among them，the increase of p hydroxybenzoic acid and syringic acid in the susceptible rhizosphere soil of Yuxi experiment reached 31.0% and 35.0%，which were significantly different.At the same time，ferulic acid，cinnamic acid and vanillic acid also showed a cumulative effect，which increased respectively compared with healthy rhizosphere soil.In the same way，the vanillic acid content in the soil samples of Jiuxiang test changed greatly.The content in the rhizosphere soil of susceptible tobacco plants increased by 38% compared with healthy tobacco plants.The content of formic acid changed slightly，only increasing by 2.5%，while the content of syringic acid，ferulic acid and cinnamic acid increased by 17%，5.4% and 21.5% respectively compared with healthy soil.[Conclusion]The above results indicate that the content and potential functions of phenolic acids in the rhizosphere soil of susceptible tobacco plants are significantly different from those of healthy tobacco plants.Biological factors and non biological factors in the soil micro ecological environment interact with each other，which affects rhizosphere soil phenolic acids.The change characteristics of the similar substances play an important role;at the same time，the differences in natural and management conditions in different regions，and the selection and adaptation of plants to different niches may cause major changes in the composition and content of root exudates. Key words Tobacco;Tobacco planting soil;Root knot nematodes;Phenolic acids
根结线虫是常见的植物寄生性线虫，全世界每年由它所造成的重要经济作物产量损失高达数百亿美元[1]。对于许多国家而言，根结线虫也是限制本国烟草生产的主要因素之一。根结线虫在我国多个烟区危害极为严重，仅云南省每年就有2万～3万株健康烟草被根结线虫侵染，并使烟草产量下降30%～40%[2]。目前，关于烟草根结线虫在种类鉴定[3]、生物学防治[4-5]及其对土壤微生物影响[6]的研究较多，但对于根结线虫所寄生的烟草根际土壤酚酸类物质含量及变化特征的研究甚少。因此，对根结线虫侵染烟株的根际土壤酚酸类物质进行研究，对了解烟草根结线虫的侵染规律以及对烟草线虫的综合防治具有重要意义。酚酸类物质在自然条件下进入土壤环境的途径多样，主要依靠植物根系分泌、淋溶、残体降解等[7-8]。酚酸类物质是一类通过影响植物膜系统、光合作用、酶活性[9-10]等来抑制作物生长且对土壤微生物多样性及群落结构造成重要影响[11]的自毒化感物质[12-13]。研究表明，不同抗性番茄砧木幼苗对线虫卵孵化起到不同程度的抑制或促进作用[14-15];植物根系分泌物中的苹果酸、草酸、对氨基苯甲酸、乳酸、丙酸和戊酸对南方根结线虫趋化性有明显作用[16];黄瓜及其砧木根系分泌物对根结线虫卵孵化有显著影响[17];易感大豆根系分泌物中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸可吸引大豆包囊线虫[18]。由此可见，酚酸类物质在作物根际土壤中积累一定程度上促进或抑制线虫病害的发生，并最终影响作物产量。因此，通过研究作物根系分泌物种类、含量及变化趋势来克服线虫病害已成为近几年的研究热点。笔者以受根结线虫侵染烟草的根际土壤为试验材料，采用高效液相色谱技术，对根际土壤酚酸类物质种类、含量进行测定，并对其变化趋势进行分析，以探明根结线虫侵染对烤烟根际土壤酚酸类物质的影响，为缓解烤烟根结线虫病害、提高烟草产量和质量提供理論依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况 试验于2018年6月在云南省玉溪市红塔区高仓街道 （103°32′E，24°30′ N） 和云南省昆明市宜良县九乡 （103°20′31″E，25°1′43″N） 进行。
玉溪市红塔区年均降雨量779.5 ～ 989.7 mm，年平均气温15.6 ～ 23.8 ℃，年无霜期244～365 d，年平均日照2 115 ～ 2 285 h。试验地海拔为1 760 m，土壤类型为红壤土，灌溉方式为穴灌，前茬作物为小麦，土地相对平坦，排水良好。
昆明市宜良县年均降雨量为526.9 ～ 898.9 mm，年平均气温16.3 ～ 21.7 ℃，年无霜期260 d 左右，年平均日照2 032 h 左右。试验地海拔为1 560 m，土壤类型为红壤土。
1.2 样品采集
供试样品于2018年6月分别在2个试验烟区采集，选取烤烟根结线虫感病典型且严重的烟田。根际土壤样品分别命名为 JX-P （九乡感病土）、YX-P （玉溪感病土）、JX-H （九乡健康土） 和YX-H （玉溪健康土）。土样采集：在同一地块中 （土质一致） 选取未患根结线虫病且生长完全正常的烟株和具有烤烟根结线虫病典型症状的烟株各3株，收集附着在根0 ～ 4 mm的土壤作为根际土 （优先采集健康烟株根际土样）。
1.3 根际土壤酚酸物质测定
1.3.1 仪器和试剂。Waters 2695 高效液相色谱仪，Waters 2487 可变波长检测器 （美国 Waters 公司）; Empower 色谱数据工作站;高纯水制备仪 （MilliQ，Millipore）。
阔马酸 （批号 U4CGB - MC）、对羟基苯甲酸 （批号 CB27）、香草酸 （批号 DM29）、丁香酸 （批号 CL28）、4-香豆酸 （批号 C10067978）、阿魏酸 （批号 1709277），各标准品纯度均大于98%。
1.3.2 溶液配制。
分别精密称定标准品阔马酸0.010 2 g、对羟基苯甲酸0.010 1 g、香草酸0.010 2 g、丁香酸0.010 2 g、4-香豆酸0.010 2 g、阿魏酸0.010 2 g、肉桂酸0.010 2 g 置于同一100 mL 容量瓶中，用99.9% 的色谱级甲醇精确定容100 mL，配制为100 mg/L 浓度的混合标液，4 ℃ 避光保存，待用。
1.3.3 样品处理。
供试烤烟根际土壤风干，除去须根等杂物，过40目筛，称取50 g 置于250 mL 具塞三角瓶中，加入150 mL 2 mol/L NaOH，120 r/min 振荡提取3 h，静置3 h，用滤纸过滤。取上清液用5 mol/L HCl 调至 pH 为2.5。然后用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，45 ℃ 蒸干，残渣用5 mL 色谱纯甲醇溶解，4 ℃ 避光保存。过0.22 μm 滤膜，待测。
1.3.4 色谱条件。
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国 WATERS 公司）;流动相A：0.3% 乙酸水溶液;流动相B：甲醇。梯度洗脱：0 min，流动相A 95%，B 5%;1 min，流动相A 80%，B 20%;5 min，流动相A 70%，B 30%;7.5 min，流动相A 20%，B 80%;10 min，流动相A 95%，B 5%;流速为0.3 mL/min;柱温3 ℃;进样量10 μL。每个样品分析结束后，进样延迟1 min。
1.4 数据处理 试验数据利用 SPSS 22.0 数据分析软件进行统计分析，结合 WPS Office 2019 软件进行数据处理及作图。 2 结果与分析
2.1 受根结线虫侵染及健康烤烟根际土壤酚酸类物质种类鉴定 由图1可知，标准品共进阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸及肉桂酸7种酚酸类物质，在不同烟区健康和感病烟株根际土壤共4组处理中均检测出6种酚酸类物质，分别为对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸和肉桂酸（图2～5）。
2.2 根结线虫侵染对烤烟根际土壤酚酸类物质的影响
由图6可知，根结线虫侵染会促进烟株根系对羟基苯甲酸的分泌，不同试验烟区烤烟根际土壤中对羟基苯甲酸含量均表现为患根结线虫病病土 > 健康土，其中玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 对羟基苯甲酸含量较健康土 （YX-H） 增加了31.0%，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 较健康土 （JX-H） 增加了2.5%。此外，九乡试验烟区烤烟根际土壤中羟基苯甲酸含量显著高于玉溪试验烟区，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 和健康土 （JX-H） 对羟基苯甲酸的含量分别是玉溪患根结线虫病病土 （YX-P） 和健康土 （YX-H） 的1.75和2.48倍，差异均达显著水平 （P<0.05）。
由图7可知，烤烟根系香草酸分泌量会随根结线虫病害发生而改变。不同试验烟区感病烟株根际土壤香草酸含量均高于健康株，其中玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 香草酸含量高于健康土 （YX-H） 6.7%，差异不显著;九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 较健康土 （JX-H） 增加了38%，并存在显著差异 （P<0.05）。九乡试验烟区烤烟根际土壤香草酸含量显著高于玉溪试验烟区，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 与健康土 （JX-H） 香草酸含量分别是玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 与健康土 （YX-H） 的5.57和3.68倍，差异均达显著水平 （P<0.05）。
由图8可知，根结线虫侵染刺激烟株根系丁香酸物质分泌，不同试验烟区烤烟根际土壤丁香酸含量均表现为患根结线虫病病土 > 健康土，其中玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 丁香酸含量高于健康土 （YX-H） 35%，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 丁香酸含量较健康土 （JX-H） 增加了17%。此外，九乡试验烟区烤烟根际土壤丁香酸含量显著高于玉溪試验烟区，九乡试验烤烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 和健康土丁香酸含量分别高于玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 和健康土 （YX-H） 的2.4和3.08倍，均存在显著差异 （P<0.05）。
由图9可知，根结线虫病与烤烟根系分泌阿魏酸物质相关，不同试验烟区受根结线虫侵染的烤烟根际土壤阿魏酸含量均高于健康土，其中玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 阿魏酸含量高于健康土 （YX-H） 14.7%，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 阿魏酸含量较健康土 （JX-H） 增加了5.4%。此外，九乡试验烟区烤烟根际土壤阿魏酸含量均高于玉溪试验烟区，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 和健康土 （JX-H） 阿魏酸含量分别是玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 和健康土 （YX-H） 的3.84和4.26倍，差异达显著水平 （P<0.05）。
由图10可知，烤烟根系肉桂酸物质的分泌受根结线虫病的直接影响。不同试验烟区烤烟根际土壤肉桂酸含量均表现为感病土 > 健康土。其中，玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 的肉桂酸含量较健康土 （YX-H） 增加了18%，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 的肉桂酸含量高于健康土21.5%。此外，九乡试验烟区烤烟根际土壤肉桂酸含量均高于玉溪试验烟区，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 和健康土 （JX-H） 的肉桂酸含量分别是玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 和健康土 （YX-H） 的3.36和3.22倍，九乡试验烟区患根结线虫病病土与玉溪健康土之间存在显著差异 （P<0.05）。
由图11可知，烤烟根系分泌4-香豆酸含量与根结线虫病害之间的响应关系不显著。其中，玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 4-香豆酸含量较健康土 （YX-H） 减少了50%，且存在显著差异 （P<0.05）;九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 较健康土 （JX-H） 增加了16%。此外，九乡试验烟区烤烟根际土壤4-香豆酸含量均高于玉溪试验烟区，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 和健康土 （JX-H） 4-香豆酸含量分别是玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 和健康土 （YX-H） 的3.53和1.46倍，差异达显著水平 （P<0.05）。
由图12可知，玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 酚酸类物质总含量较健康土 （YX-H） 减少了23%，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 较健康土 （JX-H） 增加了16%。且九乡试验烟区烤烟根际土壤酚酸类物质总含量显著高于玉溪试验烟区。九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 及健康土 （JX-H） 酚酸类物质总含量分别是玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 及健康土 （YX-H） 的3.11和2.11倍，差异达显著水平 （P<0.05）。
由图6～12可知，不同试验烟区健康和感病烟株根际土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸、肉桂酸、4-香豆酸及酚酸类物质总含量均为九乡 > 玉溪;除肉桂酸外，其他5种酚酸及酚酸类物质总含量的地域差异均达显著水平 （P<0.05）。
3 讨论
病虫害胁迫是影响植物根系分泌物中酚酸类物质种类和含量变化的重要因素。王弋[19]研究发现黑胫病侵染促进了烤烟根系酚酸分泌量，且不同品种根系分泌物中丁香酸和对羟基苯甲酸含量均呈上升趋势。研究表明不同抗性番茄接种南方根结线虫后，根系分泌物中酯类和酚类物质含量明显增加[15]，同样棉花、番茄砧木根系等受南方根结线虫侵染后，其根系脯氨酸含量显著增加[14，20]。该研究结果显示烤烟受根结线虫侵染后，感病烟株根际土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸和肉桂酸含量均高于健康烟株，在玉溪试验烟区土壤样品中丁香酸含量变化较大，增长35%;香草酸含量变化较小，仅增长6.7%;对羟基苯甲酸、阿魏酸及肉桂酸含量分别增长31%、14.7% 及18%。而九乡试验烟区土壤样品中香草酸含量变化较大，增长了38%;对羟基苯甲酸含量变化较小，仅增长2.5%;丁香酸、阿魏酸及肉桂酸含量分别增长17%、5.4% 及21.5%。表明根结线虫侵染后刺激烤烟根系分泌物中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸和肉桂酸的分泌，且肉桂酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸等与自毒化感作用密切相关[21-23]，进而导致土壤酚酸物质的自毒化感作用增强，并对根结线虫病害的发生造成直接或间接的影响。 该研究健康和感病烟株根际土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸、肉桂酸、4-香豆酸及酚酸类物质总含量均表现为九乡 > 玉溪，其中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸、4-香豆酸及酚酸类物质总含量的地域差异均达显著水平 （P<0.05），且2个试验烟区的土壤温度、海拔、降雨量、无霜期等自然条件以及前茬作物、施肥、灌溉等管理条件均存在一定差异。因此，可能是由于不同的自然条件和管理栽培措施会对植烟土壤造成不同的扰动，创造出不同的生态位，而植物对不同生态位的选择和适应可能会导致根系分泌物组成和含量发生较大改变，从而造成地域性差异。研究表明，土壤酚酸类物质含量受土壤理化性状的显著影响，且不同酚酸类物质间也存在不同程度的促进或抑制作用，酚酸类物质进入到环境后，又会在物理、化学及微生物作用等过程的影响下含量发生变化[24-27];杨敏等[9]研究发现，土壤酚酸类物质含量随烤烟连作年限的延长表现出升高的趋势，且施加生物炭对土壤酚酸有明显的降解作用;谢星光等[28]研究表明，内生真菌 B3 对土壤酚酸类物质含量有明显的降解作用;此外，根系土壤酚酸类物质也和连作、轮作方式、根际土壤微生物等因素息息相关[29-32]。
4 结论
该研究对根结线虫感病烟株及健康烟株根际土壤酚酸类物质种类、含量及变化趋势进行了较为全面的分析，表明感病烟株根际土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸、肉桂酸与根结线虫感病显著相关。可以进一步探寻烟草根结线虫与其他酚酸类物质及根系分泌物间的互作关系，从而选择更加高效的根结线虫预测诊断方法，并结合多种生物防治和酚酸类物质调控技术，为有效控制烟草根结线虫病提供新方法、新思路。
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WANG Qi yu1，DENG Xiao peng2，ZHANG Liu chen3 et al
（1.Yunnan Urban Agricultural Engineering & Technological Research Center，College of Agronomy，Kunming University，Kunming， Yunnan 650214;2.Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences，Kunming，Yunnan 650201;3.China National Tobacco Corporation Yunnan Company，Kunming，Yunnan 650011）
Abstract [Objective]This article takes the rhizosphere soil of tobacco root knot nematode susceptible tobacco plants as the research object to explore 7 phenols in the rhizosphere soil of healthy and susceptible tobacco plants.The change characteristics of acid substances （p hydroxybenzoic acid，syringic acid，ferulic acid，4 coumaric acid，cinnamic acid，vanillic acid，colmaric acid） provide a theoretical basis for effective prevention and control of the disease.[Method]HPLC technology was used to detect the phenolic acid content in the rhizosphere soil of susceptible and healthy tobacco plants respectively，and the difference of phenolic acid content in the rhizosphere soil of susceptible and healthy tobacco plants was analyzed.[Result]6 phenolic acids were detected in the rhizosphere soil of healthy and root knot nematode susceptible tobacco plants.Except for 4 coumaric acid，the rhizosphere soil of susceptible tobacco plants had no obvious changes.The contents of benzoic acid，vanillic acid，syringic acid，ferulic acid and cinnamic acid were all increased compared with healthy tobacco plants.Among them，the increase of p hydroxybenzoic acid and syringic acid in the susceptible rhizosphere soil of Yuxi experiment reached 31.0% and 35.0%，which were significantly different.At the same time，ferulic acid，cinnamic acid and vanillic acid also showed a cumulative effect，which increased respectively compared with healthy rhizosphere soil.In the same way，the vanillic acid content in the soil samples of Jiuxiang test changed greatly.The content in the rhizosphere soil of susceptible tobacco plants increased by 38% compared with healthy tobacco plants.The content of formic acid changed slightly，only increasing by 2.5%，while the content of syringic acid，ferulic acid and cinnamic acid increased by 17%，5.4% and 21.5% respectively compared with healthy soil.[Conclusion]The above results indicate that the content and potential functions of phenolic acids in the rhizosphere soil of susceptible tobacco plants are significantly different from those of healthy tobacco plants.Biological factors and non biological factors in the soil micro ecological environment interact with each other，which affects rhizosphere soil phenolic acids.The change characteristics of the similar substances play an important role;at the same time，the differences in natural and management conditions in different regions，and the selection and adaptation of plants to different niches may cause major changes in the composition and content of root exudates. Key words Tobacco;Tobacco planting soil;Root knot nematodes;Phenolic acids
根结线虫是常见的植物寄生性线虫，全世界每年由它所造成的重要经济作物产量损失高达数百亿美元[1]。对于许多国家而言，根结线虫也是限制本国烟草生产的主要因素之一。根结线虫在我国多个烟区危害极为严重，仅云南省每年就有2万～3万株健康烟草被根结线虫侵染，并使烟草产量下降30%～40%[2]。目前，关于烟草根结线虫在种类鉴定[3]、生物学防治[4-5]及其对土壤微生物影响[6]的研究较多，但对于根结线虫所寄生的烟草根际土壤酚酸类物质含量及变化特征的研究甚少。因此，对根结线虫侵染烟株的根际土壤酚酸类物质进行研究，对了解烟草根结线虫的侵染规律以及对烟草线虫的综合防治具有重要意义。酚酸类物质在自然条件下进入土壤环境的途径多样，主要依靠植物根系分泌、淋溶、残体降解等[7-8]。酚酸类物质是一类通过影响植物膜系统、光合作用、酶活性[9-10]等来抑制作物生长且对土壤微生物多样性及群落结构造成重要影响[11]的自毒化感物质[12-13]。研究表明，不同抗性番茄砧木幼苗对线虫卵孵化起到不同程度的抑制或促进作用[14-15];植物根系分泌物中的苹果酸、草酸、对氨基苯甲酸、乳酸、丙酸和戊酸对南方根结线虫趋化性有明显作用[16];黄瓜及其砧木根系分泌物对根结线虫卵孵化有显著影响[17];易感大豆根系分泌物中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸可吸引大豆包囊线虫[18]。由此可见，酚酸类物质在作物根际土壤中积累一定程度上促进或抑制线虫病害的发生，并最终影响作物产量。因此，通过研究作物根系分泌物种类、含量及变化趋势来克服线虫病害已成为近几年的研究热点。笔者以受根结线虫侵染烟草的根际土壤为试验材料，采用高效液相色谱技术，对根际土壤酚酸类物质种类、含量进行测定，并对其变化趋势进行分析，以探明根结线虫侵染对烤烟根际土壤酚酸类物质的影响，为缓解烤烟根结线虫病害、提高烟草产量和质量提供理論依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况 试验于2018年6月在云南省玉溪市红塔区高仓街道 （103°32′E，24°30′ N） 和云南省昆明市宜良县九乡 （103°20′31″E，25°1′43″N） 进行。
玉溪市红塔区年均降雨量779.5 ～ 989.7 mm，年平均气温15.6 ～ 23.8 ℃，年无霜期244～365 d，年平均日照2 115 ～ 2 285 h。试验地海拔为1 760 m，土壤类型为红壤土，灌溉方式为穴灌，前茬作物为小麦，土地相对平坦，排水良好。
昆明市宜良县年均降雨量为526.9 ～ 898.9 mm，年平均气温16.3 ～ 21.7 ℃，年无霜期260 d 左右，年平均日照2 032 h 左右。试验地海拔为1 560 m，土壤类型为红壤土。
1.2 样品采集
供试样品于2018年6月分别在2个试验烟区采集，选取烤烟根结线虫感病典型且严重的烟田。根际土壤样品分别命名为 JX-P （九乡感病土）、YX-P （玉溪感病土）、JX-H （九乡健康土） 和YX-H （玉溪健康土）。土样采集：在同一地块中 （土质一致） 选取未患根结线虫病且生长完全正常的烟株和具有烤烟根结线虫病典型症状的烟株各3株，收集附着在根0 ～ 4 mm的土壤作为根际土 （优先采集健康烟株根际土样）。
1.3 根际土壤酚酸物质测定
1.3.1 仪器和试剂。Waters 2695 高效液相色谱仪，Waters 2487 可变波长检测器 （美国 Waters 公司）; Empower 色谱数据工作站;高纯水制备仪 （MilliQ，Millipore）。
阔马酸 （批号 U4CGB - MC）、对羟基苯甲酸 （批号 CB27）、香草酸 （批号 DM29）、丁香酸 （批号 CL28）、4-香豆酸 （批号 C10067978）、阿魏酸 （批号 1709277），各标准品纯度均大于98%。
1.3.2 溶液配制。
分别精密称定标准品阔马酸0.010 2 g、对羟基苯甲酸0.010 1 g、香草酸0.010 2 g、丁香酸0.010 2 g、4-香豆酸0.010 2 g、阿魏酸0.010 2 g、肉桂酸0.010 2 g 置于同一100 mL 容量瓶中，用99.9% 的色谱级甲醇精确定容100 mL，配制为100 mg/L 浓度的混合标液，4 ℃ 避光保存，待用。
1.3.3 样品处理。
供试烤烟根际土壤风干，除去须根等杂物，过40目筛，称取50 g 置于250 mL 具塞三角瓶中，加入150 mL 2 mol/L NaOH，120 r/min 振荡提取3 h，静置3 h，用滤纸过滤。取上清液用5 mol/L HCl 调至 pH 为2.5。然后用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，45 ℃ 蒸干，残渣用5 mL 色谱纯甲醇溶解，4 ℃ 避光保存。过0.22 μm 滤膜，待测。
1.3.4 色谱条件。
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国 WATERS 公司）;流动相A：0.3% 乙酸水溶液;流动相B：甲醇。梯度洗脱：0 min，流动相A 95%，B 5%;1 min，流动相A 80%，B 20%;5 min，流动相A 70%，B 30%;7.5 min，流动相A 20%，B 80%;10 min，流动相A 95%，B 5%;流速为0.3 mL/min;柱温3 ℃;进样量10 μL。每个样品分析结束后，进样延迟1 min。
1.4 数据处理 试验数据利用 SPSS 22.0 数据分析软件进行统计分析，结合 WPS Office 2019 软件进行数据处理及作图。 2 结果与分析
2.1 受根结线虫侵染及健康烤烟根际土壤酚酸类物质种类鉴定 由图1可知，标准品共进阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸及肉桂酸7种酚酸类物质，在不同烟区健康和感病烟株根际土壤共4组处理中均检测出6种酚酸类物质，分别为对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸和肉桂酸（图2～5）。
2.2 根结线虫侵染对烤烟根际土壤酚酸类物质的影响
由图6可知，根结线虫侵染会促进烟株根系对羟基苯甲酸的分泌，不同试验烟区烤烟根际土壤中对羟基苯甲酸含量均表现为患根结线虫病病土 > 健康土，其中玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 对羟基苯甲酸含量较健康土 （YX-H） 增加了31.0%，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 较健康土 （JX-H） 增加了2.5%。此外，九乡试验烟区烤烟根际土壤中羟基苯甲酸含量显著高于玉溪试验烟区，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 和健康土 （JX-H） 对羟基苯甲酸的含量分别是玉溪患根结线虫病病土 （YX-P） 和健康土 （YX-H） 的1.75和2.48倍，差异均达显著水平 （P<0.05）。
由图7可知，烤烟根系香草酸分泌量会随根结线虫病害发生而改变。不同试验烟区感病烟株根际土壤香草酸含量均高于健康株，其中玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 香草酸含量高于健康土 （YX-H） 6.7%，差异不显著;九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 较健康土 （JX-H） 增加了38%，并存在显著差异 （P<0.05）。九乡试验烟区烤烟根际土壤香草酸含量显著高于玉溪试验烟区，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 与健康土 （JX-H） 香草酸含量分别是玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 与健康土 （YX-H） 的5.57和3.68倍，差异均达显著水平 （P<0.05）。
由图8可知，根结线虫侵染刺激烟株根系丁香酸物质分泌，不同试验烟区烤烟根际土壤丁香酸含量均表现为患根结线虫病病土 > 健康土，其中玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 丁香酸含量高于健康土 （YX-H） 35%，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 丁香酸含量较健康土 （JX-H） 增加了17%。此外，九乡试验烟区烤烟根际土壤丁香酸含量显著高于玉溪試验烟区，九乡试验烤烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 和健康土丁香酸含量分别高于玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 和健康土 （YX-H） 的2.4和3.08倍，均存在显著差异 （P<0.05）。
由图9可知，根结线虫病与烤烟根系分泌阿魏酸物质相关，不同试验烟区受根结线虫侵染的烤烟根际土壤阿魏酸含量均高于健康土，其中玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 阿魏酸含量高于健康土 （YX-H） 14.7%，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 阿魏酸含量较健康土 （JX-H） 增加了5.4%。此外，九乡试验烟区烤烟根际土壤阿魏酸含量均高于玉溪试验烟区，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 和健康土 （JX-H） 阿魏酸含量分别是玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 和健康土 （YX-H） 的3.84和4.26倍，差异达显著水平 （P<0.05）。
由图10可知，烤烟根系肉桂酸物质的分泌受根结线虫病的直接影响。不同试验烟区烤烟根际土壤肉桂酸含量均表现为感病土 > 健康土。其中，玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 的肉桂酸含量较健康土 （YX-H） 增加了18%，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 的肉桂酸含量高于健康土21.5%。此外，九乡试验烟区烤烟根际土壤肉桂酸含量均高于玉溪试验烟区，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 和健康土 （JX-H） 的肉桂酸含量分别是玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 和健康土 （YX-H） 的3.36和3.22倍，九乡试验烟区患根结线虫病病土与玉溪健康土之间存在显著差异 （P<0.05）。
由图11可知，烤烟根系分泌4-香豆酸含量与根结线虫病害之间的响应关系不显著。其中，玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 4-香豆酸含量较健康土 （YX-H） 减少了50%，且存在显著差异 （P<0.05）;九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 较健康土 （JX-H） 增加了16%。此外，九乡试验烟区烤烟根际土壤4-香豆酸含量均高于玉溪试验烟区，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 和健康土 （JX-H） 4-香豆酸含量分别是玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 和健康土 （YX-H） 的3.53和1.46倍，差异达显著水平 （P<0.05）。
由图12可知，玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 酚酸类物质总含量较健康土 （YX-H） 减少了23%，九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 较健康土 （JX-H） 增加了16%。且九乡试验烟区烤烟根际土壤酚酸类物质总含量显著高于玉溪试验烟区。九乡试验烟区患根结线虫病病土 （JX-P） 及健康土 （JX-H） 酚酸类物质总含量分别是玉溪试验烟区患根结线虫病病土 （YX-P） 及健康土 （YX-H） 的3.11和2.11倍，差异达显著水平 （P<0.05）。
由图6～12可知，不同试验烟区健康和感病烟株根际土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸、肉桂酸、4-香豆酸及酚酸类物质总含量均为九乡 > 玉溪;除肉桂酸外，其他5种酚酸及酚酸类物质总含量的地域差异均达显著水平 （P<0.05）。
3 讨论
病虫害胁迫是影响植物根系分泌物中酚酸类物质种类和含量变化的重要因素。王弋[19]研究发现黑胫病侵染促进了烤烟根系酚酸分泌量，且不同品种根系分泌物中丁香酸和对羟基苯甲酸含量均呈上升趋势。研究表明不同抗性番茄接种南方根结线虫后，根系分泌物中酯类和酚类物质含量明显增加[15]，同样棉花、番茄砧木根系等受南方根结线虫侵染后，其根系脯氨酸含量显著增加[14，20]。该研究结果显示烤烟受根结线虫侵染后，感病烟株根际土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸和肉桂酸含量均高于健康烟株，在玉溪试验烟区土壤样品中丁香酸含量变化较大，增长35%;香草酸含量变化较小，仅增长6.7%;对羟基苯甲酸、阿魏酸及肉桂酸含量分别增长31%、14.7% 及18%。而九乡试验烟区土壤样品中香草酸含量变化较大，增长了38%;对羟基苯甲酸含量变化较小，仅增长2.5%;丁香酸、阿魏酸及肉桂酸含量分别增长17%、5.4% 及21.5%。表明根结线虫侵染后刺激烤烟根系分泌物中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸和肉桂酸的分泌，且肉桂酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸等与自毒化感作用密切相关[21-23]，进而导致土壤酚酸物质的自毒化感作用增强，并对根结线虫病害的发生造成直接或间接的影响。 该研究健康和感病烟株根际土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸、肉桂酸、4-香豆酸及酚酸类物质总含量均表现为九乡 > 玉溪，其中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸、4-香豆酸及酚酸类物质总含量的地域差异均达显著水平 （P<0.05），且2个试验烟区的土壤温度、海拔、降雨量、无霜期等自然条件以及前茬作物、施肥、灌溉等管理条件均存在一定差异。因此，可能是由于不同的自然条件和管理栽培措施会对植烟土壤造成不同的扰动，创造出不同的生态位，而植物对不同生态位的选择和适应可能会导致根系分泌物组成和含量发生较大改变，从而造成地域性差异。研究表明，土壤酚酸类物质含量受土壤理化性状的显著影响，且不同酚酸类物质间也存在不同程度的促进或抑制作用，酚酸类物质进入到环境后，又会在物理、化学及微生物作用等过程的影响下含量发生变化[24-27];杨敏等[9]研究发现，土壤酚酸类物质含量随烤烟连作年限的延长表现出升高的趋势，且施加生物炭对土壤酚酸有明显的降解作用;谢星光等[28]研究表明，内生真菌 B3 对土壤酚酸类物质含量有明显的降解作用;此外，根系土壤酚酸类物质也和连作、轮作方式、根际土壤微生物等因素息息相关[29-32]。
4 结论
该研究对根结线虫感病烟株及健康烟株根际土壤酚酸类物质种类、含量及变化趋势进行了较为全面的分析，表明感病烟株根际土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸、肉桂酸与根结线虫感病显著相关。可以进一步探寻烟草根结线虫与其他酚酸类物质及根系分泌物间的互作关系，从而选择更加高效的根结线虫预测诊断方法，并结合多种生物防治和酚酸类物质调控技术，为有效控制烟草根结线虫病提供新方法、新思路。
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