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摘要由干旱、低温和高盐等引起的渗透胁迫是影响包括细菌、酵母和高等植物在内的多种生物生长和发育的主要环境因子。生物体自身已进化出多种机制以应答这些胁迫。文中介绍了细菌和酵母中响应渗透胁迫的双组分信号系统，对拟南芥中响应渗透胁迫的重要分子ATHK1的研究进展作了简要综述，并简单讨论了ATHK1在拟南芥逆境胁迫响应过程中的主要功能，为组氨酸激酶ATHK1的进一步合理应用提供依据。
关键词渗透胁迫；双组分系统；组氨酸激酶；ATHK1
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）07-01923-02
基金项目国家自然科学基金干旱胁迫诱导植物细胞合成脱落酸的生理与分子机理研究（项目批准号90917005）。
作者简介陈一（1985- ），男，江苏苏州人，硕士研究生，研究方向：植物逆境生理。
收稿日期20140212植物体在生长发育过程中随时面临着多种环境胁迫，由干旱、低温、高盐引发的渗透胁迫是影响植物生长的主要环境因子。植物体可感知胞外或细胞渗透势的变化，并触发多种信号转导机制，最终在分子、细胞、组织以及生理等多个水平实现对环境胁迫的应答。原核生物和低等真核生物也会对胞外渗透势的变化作出响应。细菌和酵母的双组分信号系统被认为是感知和传递胞外胁迫信号的主要机制，高等植物体内也存在类似的信号传递系统。拟南芥跨膜组氨酸激酶ATHK1被认为是一种重要的逆境胁迫响应分子。笔者对细菌和酵母中的双组分信号传递系统进行简述，介绍有关拟南芥ATHK1蛋白研究的最新进展，并对ATHK1在拟南芥响应逆境胁迫中的功能进行简单讨论，以期为组氨酸激酶ATHK1的进一步合理应用提供依据。
1大肠杆菌双组分信号系统简介
由蛋白激酶/蛋白磷酸酶调节的蛋白质的可逆磷酸化反应是细胞信号转导的重要机制。根据催化底物的特异性，蛋白激酶可分为3大类：丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶和组氨酸激酶。组氨酸激酶是细菌细胞中重要的信号感知分子，细菌可通过组氨酸激酶感知胞外环境的变化，并通过磷酸化作用将胞外信号传递至胞内，启动相应的应答。这种信号转导单元被称为双组分系统，在细菌、酵母和高等植物中都有发现[1]。基本的双组分系统由一个组氨酸激酶和一个反应调节子组成。组氨酸激酶在结构上包括一个N端输入域和一个C端激酶域，激酶域中含有一个保守的组氨酸残基；反应调节子包括一个N端接受域和一个C端输出域，接受域中含有一个保守的天冬氨酸残基。大肠杆菌的EnvAOmpR系统是细菌双组分系统的典型代表，组氨酸激酶EnvA的输入域可以感知胞外环境中渗透势的变化，并激活其内源的激酶活性，当面临高渗环境时，激酶首先催化EnvA本身的组氨酸残基磷酸化，该磷酸基团紧接着转移到反应调节子OmpR中保守的天冬氨酸残基上；反之，当处于低渗环境时，EnvA的激酶活性被抑制，并进而导致OmpR的去磷酸化。OmpR的磷酸化状态决定了其与DNA结合的能力，进而调控相关基因的表达[2-3]。
2酵母双组分信号系统简介
双组分系统并非总像大肠杆菌EnvAOmpR系统那样简单，在某些情况下，一个磷酸转移蛋白的加入，构建出一类“复杂化”的双组分系统，酵母双组分系统就是其中的典型代表。酵母双组分系统包括SLN1、YPD1和SSK1 3种组分。SLN1是一个跨膜组氨酸激酶，融合了大肠杆菌EnvA中的激酶域和OmpR中的接受域，因此被称为杂合型组氨酸激酶；YPD1是磷酸转移蛋白，是酵母双组分系统磷酸基团转移体系的中间分子；SSK1则起到反应调节子的作用，可进一步激活下游信号通路。酵母双组分系统具有与大肠杆菌EnvAOmpR系统相反的磷酸化/去磷酸化反应状态。当处于非胁迫环境时，SLN1处于活化状态，通过激酶活性催化其组氨酸残基磷酸化，该磷酸基团接着传递给同一分子接受域中的天冬氨酸残基，天冬氨酸进一步将磷酸基团传递给YPD1上的保守组氨酸残基，后者再将磷酸基团转移至SSK1上保守的天冬氨酸残基。磷酸化的SSK1不具备激活下游信号通路的能力。当处于高渗环境时，SLN1不再具有激酶活性，导致SSK1发生去磷酸化，去磷酸化的SSK1可激活下游的HOGMAPK信号通路，以产生对渗透胁迫的应答。HOGMAPK通路是目前研究地最为彻底的渗透胁迫感知信号转导通路，可激活一系列胁迫相关的应答。酵母中还发现有另一个渗透感知子SHO1，其不是双组分系统家族的成员，却是跨膜渗透调节子，通过SH3结构域与PBS2蛋白中富含组氨酸区域的直接相互作用而激活PBS2MAPK信号通路[2-3]。
3拟南芥ATHK1研究进展
3.1ATHK1是一个跨膜组氨酸激酶Urao等最先报道了一个由1 207个氨基酸残基组成的拟南芥组氨酸激酶ATHK1。序列分析表明，ATHK1拥有2个保守的结构域，分别称为传递域和接受域，ATHK1的N端带有2段疏水肽链区，表明其是一个跨膜蛋白。进一步的序列比对发现，ATHK1的传递域与CKI1蛋白具有较高的同源性（30%），而其接受域与酵母的SLN1蛋白具有较高的同源性（29%），且这2个结构域中分别含有一个保守的组氨酸残基和一个天冬氨酸残基（His508和Asp1074）。尽管已发现的几种乙烯受体型组氨酸激酶（ETR1、ERS和NR）两两之间同源性较高，但序列分析表明ATHK1与它们不具同源性。ATHK1与酵母SLN1同源，暗示其可能参与渗透胁迫的感知。Urao等利用酵母突变体的互补试验研究了ATHK1的功能。将ATHK1全长cDNA导入酵母的sln1温度敏感突变体后，可使突变体在限制温度条件下正常生长，表明ATHK1可以互补SLN1蛋白的功能。进一步研究发现，替换掉2个关键残基（His508和Asp1074）或者是去除掉N端跨膜区的ATHK1不能互补SLN1，表明这些位点是ATHK1发挥功能所必需的。Urao等运用酵母双杂交技术分析了ATHK1与拟南芥磷酸转移蛋白ATHP和拟南芥反应调节子ATRR之间的相互作用，结果表明ATHK1仅与ATHP2存在明显的相互作用[4]。后期研究则认为ATHK1可能还通过拟南芥反应调节子ATRR3/4或ATRR8/9而发挥作用[5]。Northern杂交和GUS染色表明，ATHK1在拟南芥的根部和叶片基部表达量最高。此外，干旱、低温和高盐能不同程度地诱导ATHK1表达量上升，表明逆境胁迫可通过激活ATHK1的表达而启动相应的应答。在后面的内容中，课题组将从植株整体耐旱性，逆境信号转导通路以及抗逆基因表达等方面简要综述目前有关ATHK1研究的最新进展，并对应当如何认识ATHK1在植物体内的功能作一简要的讨论。 3.2ATHK1与植株的耐胁迫能力研究者首先观察了不同基因型拟南芥的生长状况和耐旱表型，发现在非胁迫条件下，尽管野生型、athk1突变体和ATHK1过表达具有不同的ATHK1表达模式，但它们的正常生长过程并没有受到影响，也没有表现出明显的形态学差异[5-6]。但在胁迫条件下，athk1和过表达植株的存活率则分别显著低于和高于野生型（P<0.05）。Hao等发现，在特定的胁迫条件下，athk1较野生型植株具有更明显的萎蔫表型、更快的离体叶片失水速率和更高的离子渗漏率[7]。Dong等也观察到胁迫下athk1具有更高的离体叶片失水速率[8]。Kumar等在不同生态型背景的拟南芥中观察到类似的试验现象[9]。上述结果均表明，athk1的耐旱能力显著弱于相应的野生型（P<0.05）。Kumar等还观察到在athk1中，无论气孔密度还是气孔开度都显著高于野生型（P<0.05），由于气孔的数量和开放程度与植物细胞维持水分的能力密切相关，因此这很可能就是athk1耐旱能力低于野生型的原因之一。此外，athk1的叶片表皮细胞数量也明显多于野生型，提示ATHK1在调节叶片表皮细胞扩张等方面可能还具有更广泛的功能[9]。
3.3ATHK1与ABA信号转导植物激素脱落酸（ABA）是一种主要的胁迫激素，其含量在多种胁迫下显著上升（P<0.05）。ABA通过介导或整合多种信号转导途径实现对多种环境胁迫的应答[10]。研究ATHK1在ABA信号中的作用可为研究提供有关ATHK1功能的必要信息。与野生型相比，athk1突变体对ABA抑制种子萌发的效应不敏感，而ATHK1过表达则表现为超敏感[5-6]。此外，athk1突变体对ABA诱导的气孔响应也不敏感[8]。这些结果表明，ATHK1可能位于ABA的下游，作为一种正调节子参与了ABA信号的转导。Wohlbach等发现，用ABA生物合成抑制剂Fluridone处理可消除athk1突变体、野生型和过表达植株对渗透胁迫响应的差异，表明不同基因型植株对渗透胁迫响应的差别可能与它们内源的ABA含量相关，ATHK1可能位于ABA的上游，并通过ABA依赖的方式发挥作用。ABA含量测定表明，胁迫下athk1突变体的游离ABA含量显著低于野生型（P<0.05），而ATHK1过表达则显著高于野生型（P<0.05），表明ATHK1通过调节ABA含量来应答逆境胁迫[5]。为进一步研究ATHK1调控ABA含量的可能机理，Wohlbach等利用Realtime PCR技术检测了ABA生物合成相关基因ABA1、ABA2和AAO3的表达情况，结果显示ABA1、ABA2和AAO3的表达量均在athk1突变体中下调，而在过表达中上调。上述基因表达的变化与游离ABA含量测定的结果相一致，表明ATHK1通过诱导ABA合成相关基因的表达来提高游离ABA含量。综上所述，ATHK1与ABA之间存在正反馈调节，即ATHK1促进ABA的积累，ABA又进一步促进ATHK1的表达[5]。最近，Kumar等研究认为，在胁迫条件下athk1突变体中ABA生物合成关键基因NCED3的表达量显著低于野生型（P<0.05），但游离ABA含量差异不大，报道结果与前人研究结果不太一致[9]。对于Wohlbach等和Kumar等所报道结果的差异，笔者认为，这一方面可能由于2个研究组所采用的突变体来源以及胁迫处理的条件不尽相同；另一方面，由于逆境下植物体内游离ABA含量的变化涉及ABA代谢的多个环节，是ABA的合成、分解以及游离态与结合态之间相互转变的综合结果[11-13]，Wohlbach和Kumar等各自报道的可能只是相对复杂的ABA应答机制在特定条件下所表现的一个方面，至于ATHK1与ABA信号之间更加复杂的信号过程，仍需要开展更多的研究以积累更多的实验证据。
3.4ATHK1与抗逆基因表达研究不同基因型之间基因表达的差异，可为研究提供更多有关ATHK1如何执行功能的信息。Hao等利用DDRTPCR技术分离了PEG处理后野生型和athk1之间差异显示的条带，经测序和序列比对后得到12个与植物逆境应答相关的基因。其中，MAPKKK18和Ser/Thr 2个基因是MAPK信号通路中的主要成员。由此推测，ATHK1可能位于MAPK的上游，通过MAPK磷酸化级联通路而发挥作用，这与Urao等在酵母突变体中所获得的结果相一致[7]。Tran等发现，在非胁迫条件下，athk1中有16（下转第2036页）安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（7）：1925-1926，1928责任编辑石金友责任校对
关键词渗透胁迫；双组分系统；组氨酸激酶；ATHK1
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）07-01923-02
基金项目国家自然科学基金干旱胁迫诱导植物细胞合成脱落酸的生理与分子机理研究（项目批准号90917005）。
作者简介陈一（1985- ），男，江苏苏州人，硕士研究生，研究方向：植物逆境生理。
收稿日期20140212植物体在生长发育过程中随时面临着多种环境胁迫，由干旱、低温、高盐引发的渗透胁迫是影响植物生长的主要环境因子。植物体可感知胞外或细胞渗透势的变化，并触发多种信号转导机制，最终在分子、细胞、组织以及生理等多个水平实现对环境胁迫的应答。原核生物和低等真核生物也会对胞外渗透势的变化作出响应。细菌和酵母的双组分信号系统被认为是感知和传递胞外胁迫信号的主要机制，高等植物体内也存在类似的信号传递系统。拟南芥跨膜组氨酸激酶ATHK1被认为是一种重要的逆境胁迫响应分子。笔者对细菌和酵母中的双组分信号传递系统进行简述，介绍有关拟南芥ATHK1蛋白研究的最新进展，并对ATHK1在拟南芥响应逆境胁迫中的功能进行简单讨论，以期为组氨酸激酶ATHK1的进一步合理应用提供依据。
1大肠杆菌双组分信号系统简介
由蛋白激酶/蛋白磷酸酶调节的蛋白质的可逆磷酸化反应是细胞信号转导的重要机制。根据催化底物的特异性，蛋白激酶可分为3大类：丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶和组氨酸激酶。组氨酸激酶是细菌细胞中重要的信号感知分子，细菌可通过组氨酸激酶感知胞外环境的变化，并通过磷酸化作用将胞外信号传递至胞内，启动相应的应答。这种信号转导单元被称为双组分系统，在细菌、酵母和高等植物中都有发现[1]。基本的双组分系统由一个组氨酸激酶和一个反应调节子组成。组氨酸激酶在结构上包括一个N端输入域和一个C端激酶域，激酶域中含有一个保守的组氨酸残基；反应调节子包括一个N端接受域和一个C端输出域，接受域中含有一个保守的天冬氨酸残基。大肠杆菌的EnvAOmpR系统是细菌双组分系统的典型代表，组氨酸激酶EnvA的输入域可以感知胞外环境中渗透势的变化，并激活其内源的激酶活性，当面临高渗环境时，激酶首先催化EnvA本身的组氨酸残基磷酸化，该磷酸基团紧接着转移到反应调节子OmpR中保守的天冬氨酸残基上；反之，当处于低渗环境时，EnvA的激酶活性被抑制，并进而导致OmpR的去磷酸化。OmpR的磷酸化状态决定了其与DNA结合的能力，进而调控相关基因的表达[2-3]。
2酵母双组分信号系统简介
双组分系统并非总像大肠杆菌EnvAOmpR系统那样简单，在某些情况下，一个磷酸转移蛋白的加入，构建出一类“复杂化”的双组分系统，酵母双组分系统就是其中的典型代表。酵母双组分系统包括SLN1、YPD1和SSK1 3种组分。SLN1是一个跨膜组氨酸激酶，融合了大肠杆菌EnvA中的激酶域和OmpR中的接受域，因此被称为杂合型组氨酸激酶；YPD1是磷酸转移蛋白，是酵母双组分系统磷酸基团转移体系的中间分子；SSK1则起到反应调节子的作用，可进一步激活下游信号通路。酵母双组分系统具有与大肠杆菌EnvAOmpR系统相反的磷酸化/去磷酸化反应状态。当处于非胁迫环境时，SLN1处于活化状态，通过激酶活性催化其组氨酸残基磷酸化，该磷酸基团接着传递给同一分子接受域中的天冬氨酸残基，天冬氨酸进一步将磷酸基团传递给YPD1上的保守组氨酸残基，后者再将磷酸基团转移至SSK1上保守的天冬氨酸残基。磷酸化的SSK1不具备激活下游信号通路的能力。当处于高渗环境时，SLN1不再具有激酶活性，导致SSK1发生去磷酸化，去磷酸化的SSK1可激活下游的HOGMAPK信号通路，以产生对渗透胁迫的应答。HOGMAPK通路是目前研究地最为彻底的渗透胁迫感知信号转导通路，可激活一系列胁迫相关的应答。酵母中还发现有另一个渗透感知子SHO1，其不是双组分系统家族的成员，却是跨膜渗透调节子，通过SH3结构域与PBS2蛋白中富含组氨酸区域的直接相互作用而激活PBS2MAPK信号通路[2-3]。
3拟南芥ATHK1研究进展
3.1ATHK1是一个跨膜组氨酸激酶Urao等最先报道了一个由1 207个氨基酸残基组成的拟南芥组氨酸激酶ATHK1。序列分析表明，ATHK1拥有2个保守的结构域，分别称为传递域和接受域，ATHK1的N端带有2段疏水肽链区，表明其是一个跨膜蛋白。进一步的序列比对发现，ATHK1的传递域与CKI1蛋白具有较高的同源性（30%），而其接受域与酵母的SLN1蛋白具有较高的同源性（29%），且这2个结构域中分别含有一个保守的组氨酸残基和一个天冬氨酸残基（His508和Asp1074）。尽管已发现的几种乙烯受体型组氨酸激酶（ETR1、ERS和NR）两两之间同源性较高，但序列分析表明ATHK1与它们不具同源性。ATHK1与酵母SLN1同源，暗示其可能参与渗透胁迫的感知。Urao等利用酵母突变体的互补试验研究了ATHK1的功能。将ATHK1全长cDNA导入酵母的sln1温度敏感突变体后，可使突变体在限制温度条件下正常生长，表明ATHK1可以互补SLN1蛋白的功能。进一步研究发现，替换掉2个关键残基（His508和Asp1074）或者是去除掉N端跨膜区的ATHK1不能互补SLN1，表明这些位点是ATHK1发挥功能所必需的。Urao等运用酵母双杂交技术分析了ATHK1与拟南芥磷酸转移蛋白ATHP和拟南芥反应调节子ATRR之间的相互作用，结果表明ATHK1仅与ATHP2存在明显的相互作用[4]。后期研究则认为ATHK1可能还通过拟南芥反应调节子ATRR3/4或ATRR8/9而发挥作用[5]。Northern杂交和GUS染色表明，ATHK1在拟南芥的根部和叶片基部表达量最高。此外，干旱、低温和高盐能不同程度地诱导ATHK1表达量上升，表明逆境胁迫可通过激活ATHK1的表达而启动相应的应答。在后面的内容中，课题组将从植株整体耐旱性，逆境信号转导通路以及抗逆基因表达等方面简要综述目前有关ATHK1研究的最新进展，并对应当如何认识ATHK1在植物体内的功能作一简要的讨论。 3.2ATHK1与植株的耐胁迫能力研究者首先观察了不同基因型拟南芥的生长状况和耐旱表型，发现在非胁迫条件下，尽管野生型、athk1突变体和ATHK1过表达具有不同的ATHK1表达模式，但它们的正常生长过程并没有受到影响，也没有表现出明显的形态学差异[5-6]。但在胁迫条件下，athk1和过表达植株的存活率则分别显著低于和高于野生型（P<0.05）。Hao等发现，在特定的胁迫条件下，athk1较野生型植株具有更明显的萎蔫表型、更快的离体叶片失水速率和更高的离子渗漏率[7]。Dong等也观察到胁迫下athk1具有更高的离体叶片失水速率[8]。Kumar等在不同生态型背景的拟南芥中观察到类似的试验现象[9]。上述结果均表明，athk1的耐旱能力显著弱于相应的野生型（P<0.05）。Kumar等还观察到在athk1中，无论气孔密度还是气孔开度都显著高于野生型（P<0.05），由于气孔的数量和开放程度与植物细胞维持水分的能力密切相关，因此这很可能就是athk1耐旱能力低于野生型的原因之一。此外，athk1的叶片表皮细胞数量也明显多于野生型，提示ATHK1在调节叶片表皮细胞扩张等方面可能还具有更广泛的功能[9]。
3.3ATHK1与ABA信号转导植物激素脱落酸（ABA）是一种主要的胁迫激素，其含量在多种胁迫下显著上升（P<0.05）。ABA通过介导或整合多种信号转导途径实现对多种环境胁迫的应答[10]。研究ATHK1在ABA信号中的作用可为研究提供有关ATHK1功能的必要信息。与野生型相比，athk1突变体对ABA抑制种子萌发的效应不敏感，而ATHK1过表达则表现为超敏感[5-6]。此外，athk1突变体对ABA诱导的气孔响应也不敏感[8]。这些结果表明，ATHK1可能位于ABA的下游，作为一种正调节子参与了ABA信号的转导。Wohlbach等发现，用ABA生物合成抑制剂Fluridone处理可消除athk1突变体、野生型和过表达植株对渗透胁迫响应的差异，表明不同基因型植株对渗透胁迫响应的差别可能与它们内源的ABA含量相关，ATHK1可能位于ABA的上游，并通过ABA依赖的方式发挥作用。ABA含量测定表明，胁迫下athk1突变体的游离ABA含量显著低于野生型（P<0.05），而ATHK1过表达则显著高于野生型（P<0.05），表明ATHK1通过调节ABA含量来应答逆境胁迫[5]。为进一步研究ATHK1调控ABA含量的可能机理，Wohlbach等利用Realtime PCR技术检测了ABA生物合成相关基因ABA1、ABA2和AAO3的表达情况，结果显示ABA1、ABA2和AAO3的表达量均在athk1突变体中下调，而在过表达中上调。上述基因表达的变化与游离ABA含量测定的结果相一致，表明ATHK1通过诱导ABA合成相关基因的表达来提高游离ABA含量。综上所述，ATHK1与ABA之间存在正反馈调节，即ATHK1促进ABA的积累，ABA又进一步促进ATHK1的表达[5]。最近，Kumar等研究认为，在胁迫条件下athk1突变体中ABA生物合成关键基因NCED3的表达量显著低于野生型（P<0.05），但游离ABA含量差异不大，报道结果与前人研究结果不太一致[9]。对于Wohlbach等和Kumar等所报道结果的差异，笔者认为，这一方面可能由于2个研究组所采用的突变体来源以及胁迫处理的条件不尽相同；另一方面，由于逆境下植物体内游离ABA含量的变化涉及ABA代谢的多个环节，是ABA的合成、分解以及游离态与结合态之间相互转变的综合结果[11-13]，Wohlbach和Kumar等各自报道的可能只是相对复杂的ABA应答机制在特定条件下所表现的一个方面，至于ATHK1与ABA信号之间更加复杂的信号过程，仍需要开展更多的研究以积累更多的实验证据。
3.4ATHK1与抗逆基因表达研究不同基因型之间基因表达的差异，可为研究提供更多有关ATHK1如何执行功能的信息。Hao等利用DDRTPCR技术分离了PEG处理后野生型和athk1之间差异显示的条带，经测序和序列比对后得到12个与植物逆境应答相关的基因。其中，MAPKKK18和Ser/Thr 2个基因是MAPK信号通路中的主要成员。由此推测，ATHK1可能位于MAPK的上游，通过MAPK磷酸化级联通路而发挥作用，这与Urao等在酵母突变体中所获得的结果相一致[7]。Tran等发现，在非胁迫条件下，athk1中有16（下转第2036页）安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（7）：1925-1926，1928责任编辑石金友责任校对