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摘 要： 低密度脂蛋白受体（ Low density lipoprotein receptor， LDLR）与脂代谢关系密切，可以清除血浆中大部分胆固醇。近来离体研究发现，高胆固醇可以改变LDLR pre-mRNA的选择性剪接导致变异剪接体LDLR-△Exon4和LDLR-△Exon12比例上升，而其生物学功能与全长的LDLR有明显差别。有氧运动可以增加全长的LDLR的表达，起到降低血胆固醇的作用，但机制未明。新近研究表明，组蛋白修饰与pre-mRNA的选择性剪接（LDLR pre-mRNA）有密切的关系。对近年来有氧运动降低高胆固醇血症以及组蛋白修饰对于LDLR pre-mRNA选择性剪接的影响进行综述，为进一步阐述有氧运动降低高胆固醇血症机制研究提供新思路。
关键词： 有氧运动;高胆固醇血症;LDLR;选择性剪接;组蛋白修饰
中图分类号：G804.2 文献标识码：A 文章编号：1006-2076（2018）06-0078-06
Abstract： Low density lipoprotein receptor （ LDLR ） is very important in lipid metabolism， which can clear most cholesterol in plasma. Recently in vitro studies showed that LDLR pre-mRNA alternative splicing can be altered by hypercholesteremia. In contrast to LDLR-FL， LDLR-△Exon4 and LDLR-△Exon12 expressions were increased by cholesterol-inducible. The biological role of LDLR-△Exon4 and LDLR-△Exon12 are significantly different from LDLR-FL. Aerobic exercise can degrade the blood lipids by increasing the expression of LDLR， but the mechanism is unknown. Alternative splicing of pre-mRNA is a prominent mechanism to generate protein diversity， yet its regulation is poorly understood. Histone modifications may have a significant effects in alternative splicing. We will focus on histone modification of LDLR pre-mRNA alternative splicing. In this study， we will summarize aerobic exercise reducing hypercholesterolemia and the histone modification for the impact of LDLR pre-mRNA alternative splicing， which provide useful references for the mechanism of aerobic exercise reducing hypercholesterolemia.
Key words： aerobic exercise;hypercholesteremia;LDLR;alternative splicing;histone modification
1 LDLR简介
研究表明， 低密度脂蛋白受体 （ Low density lipoprotein receptor， LDLR） 是一种表达丰富的膜糖蛋白，尤其在肝细胞中含量最多。LDLR的主要功能是清除血浆中的胆固醇，因此与脂代谢关系密切。该受体基因的异常可导致血浆中的胆固醇水平明显升高，形成高胆固醇血症。而动脉粥样硬化形成的首要危险因素就是高胆固醇血症，动脉粥样硬化可以引发冠心病、脑血管疾病，严重威胁着人类的健康。因此，防治高胆固醇血症对控制心脑血管疾病的发病率和死亡率具有非常重要的现实意义[1]。
人类的LDLR基因全长约为45 kb，有17个内含子和18个外显子，该基因位于第19号染色体的断臂[2]。LDLR 蛋白分子量约为160 KD，由839个氨基酸残基组成，共有5个功能相异的结构域：1）配体结合结构域，由外显子2～6编码，292个氨基酸残基组成;2）表皮生长因子（EGF）前体结构域，由外显子7～14编码，400个氨基酸残基组成;3）糖链化结构域，由外显子15编码，58个氨基酸残基组成;4）跨膜结构域，外显子16、17的部分序列编码，22个氨基酸残基组成;5）胞浆结构域，由外显子17的部分序列及外显子18编码，50个氨基酸残基组成[2]（图[KG-*9]1A）。LDLR的主要功能是摄取血液中的低密度脂蛋白（LDL）或其他含ApoB100、E的脂蛋白如极低密度脂蛋白（VLDL）等，将他们内吞入细胞获得胆固醇，用于固醇类激素的合成及细胞增殖，这种代谢过程称为LDLR途径（LDLR pathway）。试想如果LDLR表达减少或功能受损，不能有效清除血液循环中的LDL及VLDL，就会导致高胆固醇血症以及其他心脑血管疾病[3]。
2 有氧运动对于LDLR的影响
有氧运动，是指以有氧氧化为供能方式的运动，供能的主要物质糖可以完全分解为水和二氧化碳，并释放出大量的能量供给人体，通过有氧运动可以有效地提高人体的心肺功能。有氧運动的特点包括低强度、长时间、慢速度、长距离等。有氧运动多是一些周期性的运动，例如走、跑、骑自行车、游泳和划船等。人体和动物实验研究都证明，适度的有氧运动可以有效地降低血液中的血脂水平，包括总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），同时可以升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），起到很好的降低血脂的作用[4-6]。 目前为止，对于有氧运动是如何影响LDLR的报道很少，但是结果比较一致。这些研究结果都认为有氧运动可以增加LDLR的转录和表达，并能增加LDLR的活性，从而可以有效地改善血脂水平。颜宜苣等的研究显示，高胆固醇血症大鼠肝脏的LDLR活性下降，而通过耐力性运动训练之后LDLR活性升高，从而起到降低血脂的作用[7]。还有研究发现，大鼠有氧运动组肝脏的LDLR mRNA水平比高脂组高3倍，LDLR的蛋白表达水平也比高脂组高1倍左右[8]。Wilund等在研究大鼠通过耐力运动减少胆结石形成时发现，有氧运动组大鼠肝脏的LDLR增加了大约2倍[9]。此外，还有人体实验证明，步行可以通过增加LDLR的表达从而起到降低胆固醇的作用[10]。
有氧运动是如何引起LDLR转录表达增加的具体机制还不清楚，可能与以下因素有关：1）过氧化物酶增殖活化受体（PPAR）：运动可使肝脏中的PPARα在转录和翻译水平上有所提高，而PPARα可诱导LDLR的转录和表达，从而降低血中的LDL含量[11]。2）胰岛素：研究显示，胰岛素可以促进LDLR启动子活化，从而增强其转录活性[12]，而有氧耐力运动可以提高肝组织对胰岛素的敏感性。3）雌激素：雌激素可以上调LDLR的活性，从而起到降低胆固醇的效应[13]，而有氧运动可以显著提高绝经妇女的雌激素水平[14]。
3 LDLR pre-mRNA的选择性剪接
选择性剪接是转录后基因表达调控的一个重要方面，是高等真核生物利用有限数量的基因产生众多蛋白质的主要机制[15]。根据序列测定方法论显示人类基因有95%以上都经历了选择性剪接[16]。
Tveten等在人的8种不同组织和4种不同细胞系中提取总RNA，使用不同引物（RT-PCR分析）证实 LDLR pre-mRNA 存在很多变异剪接体 [17]。通过对外显子1～8及外显子3～10的分析发现了外显子4的缺失，对外显子7～14和外显子11～17的分析发现了外显子12的不表达[17]。研究发现，这两种缺失的变异剪接体与高胆固醇血症密切相关[18]。此外，还发现有其他的变异剪接体形式。
从图1B中可以看到，人的LDLR全长（LDLR-FL）共有18个外显子，缺失第4外显子后，共缺失了127个氨基酸残基，此区域位于配体结合结构域（外显子2～6编码），因此缺失第4外显子的变异剪接体 （LDLR-△Exon4）影响与配体 LDL 的结合。缺失第12外显子后，共缺失了47个氨基酸残基，缺失的区域位于EGF前体结构域（外显子7～14编码），此区域属于细胞膜外结构蛋白，对 LDLR 起着支撑作用。所以缺失第12外显子的变异剪接体 （LDLR-△Exon12） 也会部分失去 LDLR 的功能，从而影响对胆固醇的清除[19-20]。
Medina等人的研究显示，培养 HepG2 肝细胞系，当胆固醇缺失时，选择性变异剪接体无论是 LDLR-△Exon4 还是 LDLR-△Exon12 的表达都下降，而加入LDL-胆固醇或是25-羟基胆固醇时，表达则明显上升（图2）。过量胆固醇喂养的非洲绿猴肝脏，经 RT-PCR 分析 LDLR-FL 表达下降，另外肝的总胆固醇的增加与 LDLR-△Exon12 的增加有正比例关系[18]。这些都提示在高胆固醇血症时，LDLR pre-mRNA 的选择性剪接与正常情况不同。
A：LDLR 结构示意图。LDLR 由5个不同功能的结构域组成，即配体结合结构域、EGF前体结构域、糖链化结构域、跨膜结构域和胞浆结构域。B：LDLR全长及其选择性变异剪接体模式图。LDLR-FL 有18个外显子，缺失第4外显子后，共缺失127个氨基酸残基，且此区域位于配体结合结构域（外显子2～6编码）;缺失第12外显子后，共缺失47个氨基酸残基，缺失区域位于EGF前体结构域（外显子7～14编码）。这预示着无论是 LDLR-△Exon4 还是 LDLR-△Exon12 与 LDLR-FL 的生物学功能都有差别。
HepG2 细胞系被孵育 10%LPDS（缺乏脂蛋白血清）或是 10%FBS（胎牛血清）。24小时之后 10%FBS 孵育的细胞加入 50 mg/ml LDL-胆固醇或是 1 mg/ml 25-羥基胆固醇。从图2中可以看到用缺乏脂蛋白血清培养的细胞，无论是LDLR-△Exon4 还是LDLR-△Exon12 的表达都下降，而加入LDL-胆固醇或是25-羟基胆固醇时，表达明显上升。在正常培养条件下的表达为1，显示的值为与正常培养条件下的比（图片摘自 Marisa W M，2011）。
4 表观遗传机制对Pre-mRNA选择性剪接的调控作用研究现状
选择性剪接是一个复杂的动态过程，其调控机制更是涉及到多水平、多因素的综合作用。以往认为选择性剪接的调控主要涉及顺式作用元件和反式作用因子（顺式作用元件包括剪接增强子和沉默子，可位于内含子也可位于外显子，反式作用因子就是剪接调节蛋白，主要包括SR蛋白家族和 hnRNPs 等），剪接调节蛋白可与剪接增强子或沉默子结合，从而调控选择性剪接[21]。而最新的研究表明，表观遗传机制尤其是组蛋白修饰参与选择性剪接的调控[22]。例如，在细胞系中加入组蛋白脱乙酰基酶抑制剂 TSA 后，可引起纤维结合蛋白的选择性外显子33被切除，以及神经细胞粘附分子的外显子18也可被切除[23-24]。这些研究说明组蛋白修饰在不同 pre-mRNA 的选择性剪接中发挥了重要作用。
目前认为，组蛋白修饰影响 pre-mRNA 的选择性剪接主要有两个机制：
1）招募模型机制 组蛋白的不同修饰可以招募不同的染色质结合蛋白以及剪接因子，从而改变 pre-mRNA 的选择性剪接格局。人的纤维母细胞生长因子受体2（human fibroblast growth factor receptor 2， FGFR2）基因外显子Ⅲb 和 Ⅲc 是互相排斥的，而且存在组织特异性。这两个外显子在不同组织的保留是由多聚嘧啶束结合蛋白（PTB，可与剪接因子 U2AF 竞争结合3’剪接位点，从而对 pre-mRNA 的剪接起到负性调控作用[35]）进行调节的，PTB 结合在外显子Ⅲb周围的沉默元件上，从而导致外显子Ⅲb被切除。在前列腺上皮细胞外显子Ⅲb 表达，这时 H3K27 三甲基化、H3K4 三甲基化含量较高;而间充质干细胞主要表达外显子Ⅲc，此时 H3K4 的一甲基化、H3K36 的三甲基化比较丰富[25]。其机制解释为：当 H3K36 的三甲基化含量丰富时，可与染色质结合蛋白（MRG15）结合，MRG15又可与 PTB 相连，通过 PTB 与剪接因子 U2AF 竞争结合3’剪接位点，从而影响外显子Ⅲb使其被剪切掉[25];H3K36 的三甲基化还可以识别染色质结合蛋白Psip1，招募剪接因子 SRSF1，对选择性剪接进行调节[26]。除此之外，细胞周期蛋白D1（CHD1）可以特异地识别 H3K4 的三甲基化，并与 U2snRNP 相互作用，继而影响选择性剪接的发生[27];Gcn5 可以与组蛋白 H3 的乙酰化位点结合，招募剪接因子 U2snRNP[28];HP1α 蛋白能识别组蛋白 H3K9 的三甲基化，招募剪接因子 hnRNPs，从而影响选择性剪接的格局[29]（图3）。 2）动态模型机制 研究表明染色体的组蛋白修饰可以改变 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸速率，而 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸速率可以影响剪接因子与内含子3’剪接位点的识别，从而产生不同的选择性剪接格局。因此，动态模型机制主要涉及两个关键因素：① 在不同内含子3’端存在剪接位点强弱的差别[30];② RNA 聚合酶Ⅱ延伸速率存在差别，由此形成转录速度的快慢从而影响选择性剪接。在生理条件下，组蛋白修饰的格局利于 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸速率较慢，剪接因子可对较强的或较弱的剪接位点都进行识别，依次将内含子切除产生完整（全长）肽段;当受到刺激时组蛋白修饰的格局发生变化，RNA聚合酶Ⅱ延伸速率加快，这时剪接因子直接识别较强的剪接位点，从而使与较弱剪接位点相连的外显子被切除的概率大大增加[31-32]。研究显示，组蛋白H3K9、H3K27、H3K36等乙酰化及甲基化水平的改变，可以影响 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸速率，从而导致选择性剪接形式的改变[33-34]。
5 有氧运动是否可通过影响LDLR pre-mRNA的选择性剪接降低血胆固醇
前已述及，高胆固醇血症时，肝脏的LDLR表达下调，而通过有氧运动可以上调LDLR 在肝脏的转录和蛋白表达，从而减少脂质沉积，促进脂质清除，起到降低血胆固醇的作用[7-10]。但是有氧运动是如何引起LDLR表达增加，机制未明，以及有氧运动对于LDLR pre-mRNA的选择性剪接是否有影响均没有文献报道。因此，我们提出了假设，在高胆固醇血症时，LDLR pre-mRNA的选择性剪接发生了改变，LDLR-FL减少，选择性变异剪接体LDLR-△Exon4和LDLR-△Exon12增加（由于选择性变异剪接体与全长的功能有明显差别，所以起不到降低胆固醇的作用），从而影响对LDL的清除;而在有氧运动时，LDLR-FL表达增加，选择性变异剪接体LDLR-△Exon4和LDLR-△Exon12减少，从而可以有效地降低血液中的胆固醇。此外，我们的前期实验已经初步证实，在高胆固醇血症时，LDLR的选择性剪接确实发生了改变，包含Exon4的LDLR表达减少，而选择性变异剪接体LDLR-△Exon4表达增加;而在有氧运动时，包含Exon4的LDLR表达增加，选择性变异剪接体LDLR-△Exon4表达减少，这与我们的假设相吻合，有氧运动确实可以改变LDLR pre-mRNA的选择性剪接。由于LDLR的变异剪接体LDLR-△Exon12与高胆固醇血症也密切相关[18]，因此，高胆固醇血症及有氧运动干预后对LDLR-△Exon12的表达是否有影响，还有待于我们的进一步实验。
6 LDLR pre-mRNA选择性剪接组蛋白修饰机制调控
组蛋白修饰对于选择性剪接调节的直接证据来自于分析一系列基因的组蛋白修饰与选择性剪接的关系，研究发现，一些基因的选择性剪接依赖于多聚嘧啶束结合蛋白（PTB）剪接因子[29]。PTB 可以与剪接因子 U2AF 竞争结合3’剪接位点，从而对 pre-mRNA 的剪接起到负性调控作用[35]。Marisa 等人的研究显示，HepG2 细胞系转染 PTB 的干扰 RNA 后，PTB mRNA 表达下降到68%，蛋白表达下调到66%。此时，检测到选择性变异剪接体 LDLR-△Exon4 和 LDLR-△Exon12表达都下调，说明 LDLR 是 PTB 作用的靶基因[18]（图4）。因此，我们推论 LDLR pre-mRNA 的第4、第12外显子缺失是由 PTB 进行调节的，那么根据招募模型机制推测，在高胆固醇血症时，组蛋白修饰的格局（H3K36 的三甲基化水平在外显子4或12周围水平升高），可与染色质结合蛋白（MRG15）结合，MRG15 又可与 PTB 相连，通过 PTB 与剪接因子 U2AF 竞争结合 3’剪接位点，从而影响外显子4或12使其被切除，LDLR-△Exon4 和 LDLR-△Exon12 产物的比例将明显上升，LDLR-FL 表达下降，从而不能有效地降低血胆固醇（图5）。简言之，组蛋白修饰可能在 LDLR pre-mRNA 的选择性剪接中发挥了重要作用。
RNA干扰PTB后，从图4中我们可以看到LDLR-△Exon4和LDLR-△Exon12产物表达下调。在正常培养条件下的表达为1，所得值为与正常培养条件的比（图片摘自 Marisa W M，2011）。
7 小结
有氧运动可以上调LDLR 在肝脏的表达，降低血胆固醇早有文献报道，但其确切的机制尚不清楚。我们的实验结果已经初步证实，有氧运动可以改变LDLR pre-mRNA的选择性剪接，LDLR-FL表达增加，选择性变异剪接体LDLR-△Exon4減少，从而可以有效降低血液中的胆固醇。但是LDLR pre-mRNA的选择性剪接又受谁调控，组蛋白修饰又在其中起到了什么样的作用，都需进一步研究。
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Abstract： Low density lipoprotein receptor （ LDLR ） is very important in lipid metabolism， which can clear most cholesterol in plasma. Recently in vitro studies showed that LDLR pre-mRNA alternative splicing can be altered by hypercholesteremia. In contrast to LDLR-FL， LDLR-△Exon4 and LDLR-△Exon12 expressions were increased by cholesterol-inducible. The biological role of LDLR-△Exon4 and LDLR-△Exon12 are significantly different from LDLR-FL. Aerobic exercise can degrade the blood lipids by increasing the expression of LDLR， but the mechanism is unknown. Alternative splicing of pre-mRNA is a prominent mechanism to generate protein diversity， yet its regulation is poorly understood. Histone modifications may have a significant effects in alternative splicing. We will focus on histone modification of LDLR pre-mRNA alternative splicing. In this study， we will summarize aerobic exercise reducing hypercholesterolemia and the histone modification for the impact of LDLR pre-mRNA alternative splicing， which provide useful references for the mechanism of aerobic exercise reducing hypercholesterolemia.
Key words： aerobic exercise;hypercholesteremia;LDLR;alternative splicing;histone modification
1 LDLR简介
研究表明， 低密度脂蛋白受体 （ Low density lipoprotein receptor， LDLR） 是一种表达丰富的膜糖蛋白，尤其在肝细胞中含量最多。LDLR的主要功能是清除血浆中的胆固醇，因此与脂代谢关系密切。该受体基因的异常可导致血浆中的胆固醇水平明显升高，形成高胆固醇血症。而动脉粥样硬化形成的首要危险因素就是高胆固醇血症，动脉粥样硬化可以引发冠心病、脑血管疾病，严重威胁着人类的健康。因此，防治高胆固醇血症对控制心脑血管疾病的发病率和死亡率具有非常重要的现实意义[1]。
人类的LDLR基因全长约为45 kb，有17个内含子和18个外显子，该基因位于第19号染色体的断臂[2]。LDLR 蛋白分子量约为160 KD，由839个氨基酸残基组成，共有5个功能相异的结构域：1）配体结合结构域，由外显子2～6编码，292个氨基酸残基组成;2）表皮生长因子（EGF）前体结构域，由外显子7～14编码，400个氨基酸残基组成;3）糖链化结构域，由外显子15编码，58个氨基酸残基组成;4）跨膜结构域，外显子16、17的部分序列编码，22个氨基酸残基组成;5）胞浆结构域，由外显子17的部分序列及外显子18编码，50个氨基酸残基组成[2]（图[KG-*9]1A）。LDLR的主要功能是摄取血液中的低密度脂蛋白（LDL）或其他含ApoB100、E的脂蛋白如极低密度脂蛋白（VLDL）等，将他们内吞入细胞获得胆固醇，用于固醇类激素的合成及细胞增殖，这种代谢过程称为LDLR途径（LDLR pathway）。试想如果LDLR表达减少或功能受损，不能有效清除血液循环中的LDL及VLDL，就会导致高胆固醇血症以及其他心脑血管疾病[3]。
2 有氧运动对于LDLR的影响
有氧运动，是指以有氧氧化为供能方式的运动，供能的主要物质糖可以完全分解为水和二氧化碳，并释放出大量的能量供给人体，通过有氧运动可以有效地提高人体的心肺功能。有氧運动的特点包括低强度、长时间、慢速度、长距离等。有氧运动多是一些周期性的运动，例如走、跑、骑自行车、游泳和划船等。人体和动物实验研究都证明，适度的有氧运动可以有效地降低血液中的血脂水平，包括总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），同时可以升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），起到很好的降低血脂的作用[4-6]。 目前为止，对于有氧运动是如何影响LDLR的报道很少，但是结果比较一致。这些研究结果都认为有氧运动可以增加LDLR的转录和表达，并能增加LDLR的活性，从而可以有效地改善血脂水平。颜宜苣等的研究显示，高胆固醇血症大鼠肝脏的LDLR活性下降，而通过耐力性运动训练之后LDLR活性升高，从而起到降低血脂的作用[7]。还有研究发现，大鼠有氧运动组肝脏的LDLR mRNA水平比高脂组高3倍，LDLR的蛋白表达水平也比高脂组高1倍左右[8]。Wilund等在研究大鼠通过耐力运动减少胆结石形成时发现，有氧运动组大鼠肝脏的LDLR增加了大约2倍[9]。此外，还有人体实验证明，步行可以通过增加LDLR的表达从而起到降低胆固醇的作用[10]。
有氧运动是如何引起LDLR转录表达增加的具体机制还不清楚，可能与以下因素有关：1）过氧化物酶增殖活化受体（PPAR）：运动可使肝脏中的PPARα在转录和翻译水平上有所提高，而PPARα可诱导LDLR的转录和表达，从而降低血中的LDL含量[11]。2）胰岛素：研究显示，胰岛素可以促进LDLR启动子活化，从而增强其转录活性[12]，而有氧耐力运动可以提高肝组织对胰岛素的敏感性。3）雌激素：雌激素可以上调LDLR的活性，从而起到降低胆固醇的效应[13]，而有氧运动可以显著提高绝经妇女的雌激素水平[14]。
3 LDLR pre-mRNA的选择性剪接
选择性剪接是转录后基因表达调控的一个重要方面，是高等真核生物利用有限数量的基因产生众多蛋白质的主要机制[15]。根据序列测定方法论显示人类基因有95%以上都经历了选择性剪接[16]。
Tveten等在人的8种不同组织和4种不同细胞系中提取总RNA，使用不同引物（RT-PCR分析）证实 LDLR pre-mRNA 存在很多变异剪接体 [17]。通过对外显子1～8及外显子3～10的分析发现了外显子4的缺失，对外显子7～14和外显子11～17的分析发现了外显子12的不表达[17]。研究发现，这两种缺失的变异剪接体与高胆固醇血症密切相关[18]。此外，还发现有其他的变异剪接体形式。
从图1B中可以看到，人的LDLR全长（LDLR-FL）共有18个外显子，缺失第4外显子后，共缺失了127个氨基酸残基，此区域位于配体结合结构域（外显子2～6编码），因此缺失第4外显子的变异剪接体 （LDLR-△Exon4）影响与配体 LDL 的结合。缺失第12外显子后，共缺失了47个氨基酸残基，缺失的区域位于EGF前体结构域（外显子7～14编码），此区域属于细胞膜外结构蛋白，对 LDLR 起着支撑作用。所以缺失第12外显子的变异剪接体 （LDLR-△Exon12） 也会部分失去 LDLR 的功能，从而影响对胆固醇的清除[19-20]。
Medina等人的研究显示，培养 HepG2 肝细胞系，当胆固醇缺失时，选择性变异剪接体无论是 LDLR-△Exon4 还是 LDLR-△Exon12 的表达都下降，而加入LDL-胆固醇或是25-羟基胆固醇时，表达则明显上升（图2）。过量胆固醇喂养的非洲绿猴肝脏，经 RT-PCR 分析 LDLR-FL 表达下降，另外肝的总胆固醇的增加与 LDLR-△Exon12 的增加有正比例关系[18]。这些都提示在高胆固醇血症时，LDLR pre-mRNA 的选择性剪接与正常情况不同。
A：LDLR 结构示意图。LDLR 由5个不同功能的结构域组成，即配体结合结构域、EGF前体结构域、糖链化结构域、跨膜结构域和胞浆结构域。B：LDLR全长及其选择性变异剪接体模式图。LDLR-FL 有18个外显子，缺失第4外显子后，共缺失127个氨基酸残基，且此区域位于配体结合结构域（外显子2～6编码）;缺失第12外显子后，共缺失47个氨基酸残基，缺失区域位于EGF前体结构域（外显子7～14编码）。这预示着无论是 LDLR-△Exon4 还是 LDLR-△Exon12 与 LDLR-FL 的生物学功能都有差别。
HepG2 细胞系被孵育 10%LPDS（缺乏脂蛋白血清）或是 10%FBS（胎牛血清）。24小时之后 10%FBS 孵育的细胞加入 50 mg/ml LDL-胆固醇或是 1 mg/ml 25-羥基胆固醇。从图2中可以看到用缺乏脂蛋白血清培养的细胞，无论是LDLR-△Exon4 还是LDLR-△Exon12 的表达都下降，而加入LDL-胆固醇或是25-羟基胆固醇时，表达明显上升。在正常培养条件下的表达为1，显示的值为与正常培养条件下的比（图片摘自 Marisa W M，2011）。
4 表观遗传机制对Pre-mRNA选择性剪接的调控作用研究现状
选择性剪接是一个复杂的动态过程，其调控机制更是涉及到多水平、多因素的综合作用。以往认为选择性剪接的调控主要涉及顺式作用元件和反式作用因子（顺式作用元件包括剪接增强子和沉默子，可位于内含子也可位于外显子，反式作用因子就是剪接调节蛋白，主要包括SR蛋白家族和 hnRNPs 等），剪接调节蛋白可与剪接增强子或沉默子结合，从而调控选择性剪接[21]。而最新的研究表明，表观遗传机制尤其是组蛋白修饰参与选择性剪接的调控[22]。例如，在细胞系中加入组蛋白脱乙酰基酶抑制剂 TSA 后，可引起纤维结合蛋白的选择性外显子33被切除，以及神经细胞粘附分子的外显子18也可被切除[23-24]。这些研究说明组蛋白修饰在不同 pre-mRNA 的选择性剪接中发挥了重要作用。
目前认为，组蛋白修饰影响 pre-mRNA 的选择性剪接主要有两个机制：
1）招募模型机制 组蛋白的不同修饰可以招募不同的染色质结合蛋白以及剪接因子，从而改变 pre-mRNA 的选择性剪接格局。人的纤维母细胞生长因子受体2（human fibroblast growth factor receptor 2， FGFR2）基因外显子Ⅲb 和 Ⅲc 是互相排斥的，而且存在组织特异性。这两个外显子在不同组织的保留是由多聚嘧啶束结合蛋白（PTB，可与剪接因子 U2AF 竞争结合3’剪接位点，从而对 pre-mRNA 的剪接起到负性调控作用[35]）进行调节的，PTB 结合在外显子Ⅲb周围的沉默元件上，从而导致外显子Ⅲb被切除。在前列腺上皮细胞外显子Ⅲb 表达，这时 H3K27 三甲基化、H3K4 三甲基化含量较高;而间充质干细胞主要表达外显子Ⅲc，此时 H3K4 的一甲基化、H3K36 的三甲基化比较丰富[25]。其机制解释为：当 H3K36 的三甲基化含量丰富时，可与染色质结合蛋白（MRG15）结合，MRG15又可与 PTB 相连，通过 PTB 与剪接因子 U2AF 竞争结合3’剪接位点，从而影响外显子Ⅲb使其被剪切掉[25];H3K36 的三甲基化还可以识别染色质结合蛋白Psip1，招募剪接因子 SRSF1，对选择性剪接进行调节[26]。除此之外，细胞周期蛋白D1（CHD1）可以特异地识别 H3K4 的三甲基化，并与 U2snRNP 相互作用，继而影响选择性剪接的发生[27];Gcn5 可以与组蛋白 H3 的乙酰化位点结合，招募剪接因子 U2snRNP[28];HP1α 蛋白能识别组蛋白 H3K9 的三甲基化，招募剪接因子 hnRNPs，从而影响选择性剪接的格局[29]（图3）。 2）动态模型机制 研究表明染色体的组蛋白修饰可以改变 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸速率，而 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸速率可以影响剪接因子与内含子3’剪接位点的识别，从而产生不同的选择性剪接格局。因此，动态模型机制主要涉及两个关键因素：① 在不同内含子3’端存在剪接位点强弱的差别[30];② RNA 聚合酶Ⅱ延伸速率存在差别，由此形成转录速度的快慢从而影响选择性剪接。在生理条件下，组蛋白修饰的格局利于 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸速率较慢，剪接因子可对较强的或较弱的剪接位点都进行识别，依次将内含子切除产生完整（全长）肽段;当受到刺激时组蛋白修饰的格局发生变化，RNA聚合酶Ⅱ延伸速率加快，这时剪接因子直接识别较强的剪接位点，从而使与较弱剪接位点相连的外显子被切除的概率大大增加[31-32]。研究显示，组蛋白H3K9、H3K27、H3K36等乙酰化及甲基化水平的改变，可以影响 RNA 聚合酶Ⅱ的延伸速率，从而导致选择性剪接形式的改变[33-34]。
5 有氧运动是否可通过影响LDLR pre-mRNA的选择性剪接降低血胆固醇
前已述及，高胆固醇血症时，肝脏的LDLR表达下调，而通过有氧运动可以上调LDLR 在肝脏的转录和蛋白表达，从而减少脂质沉积，促进脂质清除，起到降低血胆固醇的作用[7-10]。但是有氧运动是如何引起LDLR表达增加，机制未明，以及有氧运动对于LDLR pre-mRNA的选择性剪接是否有影响均没有文献报道。因此，我们提出了假设，在高胆固醇血症时，LDLR pre-mRNA的选择性剪接发生了改变，LDLR-FL减少，选择性变异剪接体LDLR-△Exon4和LDLR-△Exon12增加（由于选择性变异剪接体与全长的功能有明显差别，所以起不到降低胆固醇的作用），从而影响对LDL的清除;而在有氧运动时，LDLR-FL表达增加，选择性变异剪接体LDLR-△Exon4和LDLR-△Exon12减少，从而可以有效地降低血液中的胆固醇。此外，我们的前期实验已经初步证实，在高胆固醇血症时，LDLR的选择性剪接确实发生了改变，包含Exon4的LDLR表达减少，而选择性变异剪接体LDLR-△Exon4表达增加;而在有氧运动时，包含Exon4的LDLR表达增加，选择性变异剪接体LDLR-△Exon4表达减少，这与我们的假设相吻合，有氧运动确实可以改变LDLR pre-mRNA的选择性剪接。由于LDLR的变异剪接体LDLR-△Exon12与高胆固醇血症也密切相关[18]，因此，高胆固醇血症及有氧运动干预后对LDLR-△Exon12的表达是否有影响，还有待于我们的进一步实验。
6 LDLR pre-mRNA选择性剪接组蛋白修饰机制调控
组蛋白修饰对于选择性剪接调节的直接证据来自于分析一系列基因的组蛋白修饰与选择性剪接的关系，研究发现，一些基因的选择性剪接依赖于多聚嘧啶束结合蛋白（PTB）剪接因子[29]。PTB 可以与剪接因子 U2AF 竞争结合3’剪接位点，从而对 pre-mRNA 的剪接起到负性调控作用[35]。Marisa 等人的研究显示，HepG2 细胞系转染 PTB 的干扰 RNA 后，PTB mRNA 表达下降到68%，蛋白表达下调到66%。此时，检测到选择性变异剪接体 LDLR-△Exon4 和 LDLR-△Exon12表达都下调，说明 LDLR 是 PTB 作用的靶基因[18]（图4）。因此，我们推论 LDLR pre-mRNA 的第4、第12外显子缺失是由 PTB 进行调节的，那么根据招募模型机制推测，在高胆固醇血症时，组蛋白修饰的格局（H3K36 的三甲基化水平在外显子4或12周围水平升高），可与染色质结合蛋白（MRG15）结合，MRG15 又可与 PTB 相连，通过 PTB 与剪接因子 U2AF 竞争结合 3’剪接位点，从而影响外显子4或12使其被切除，LDLR-△Exon4 和 LDLR-△Exon12 产物的比例将明显上升，LDLR-FL 表达下降，从而不能有效地降低血胆固醇（图5）。简言之，组蛋白修饰可能在 LDLR pre-mRNA 的选择性剪接中发挥了重要作用。
RNA干扰PTB后，从图4中我们可以看到LDLR-△Exon4和LDLR-△Exon12产物表达下调。在正常培养条件下的表达为1，所得值为与正常培养条件的比（图片摘自 Marisa W M，2011）。
7 小结
有氧运动可以上调LDLR 在肝脏的表达，降低血胆固醇早有文献报道，但其确切的机制尚不清楚。我们的实验结果已经初步证实，有氧运动可以改变LDLR pre-mRNA的选择性剪接，LDLR-FL表达增加，选择性变异剪接体LDLR-△Exon4減少，从而可以有效降低血液中的胆固醇。但是LDLR pre-mRNA的选择性剪接又受谁调控，组蛋白修饰又在其中起到了什么样的作用，都需进一步研究。
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