目的建立血清中水溶性维生素B1(VB1)、B6(VB6)、烟酸、烟酰胺和叶酸的高效液相色谱同时测定方法。方法取全血40μL,用200μL甲醇沉淀蛋白,冰箱冷冻(-18℃)30 min后离心(8000 r/min,8 min),上清液通过固相萃取柱进一步净化,收集洗脱液,50℃水浴中氮气吹至0.20 mL,取50μL进样色谱柱分析。对样品的固相萃取条件和色谱条件进行优化后,用于测定人血清样品中5种水溶性维生素的含量。结果优化后的固相萃取条件:固相萃取柱AGTcleanertTMODS C18柱;洗脱液:甲醇(2.4 mL)-水(0.6 mL)混合液;洗脱流速:0.5 mL/min。本法的色谱分离条件为:分离柱Phenomenex C18 Luna色谱柱(250×4.6 mm,5μm);柱温:室温(20℃);流动相:0.05 mol/L KH2PO4溶液(pH6.0)-甲醇梯度洗脱;流速:0.9 mL/min;紫外检测波长:266 nm。5种水溶性维生素标准曲线的线性范围为0～100 ng,相关系数均大于0.999,相对标准偏差(RSD)小于5%,方法检出限(信噪比S/N=2)为0.076～0.170μg/mL,加标回收率为80.2%～115.0%。人血清样品中除烟酰胺未检出外,其余4种均检出。结论所建立的方法快速、简便、灵敏、准确,可用于人血清中水溶性维生素VB1、VB6、烟酸和叶酸的同时测定,但烟酰胺的检测灵敏度有待提高。