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【摘 要】 目的：研究宫颈癌中miR-32与PTEN之间的关系。方法：通过qRT-PCR检测miR-32、Western blot 检测PTEN在宫颈癌组织和癌旁宫颈组织中的表达，并分析PTEN表达与宫颈癌发病的关系；miR-32 mimics、inhibitors、阴性对照序列（NC），分别转染宫颈癌Hela细胞，qRT-PCR检测miR-32，Western blot 检测PTEN表达。结果：宫颈癌组织中miR-32高表达，而癌旁组织中miR-32低表达；宫颈癌组织中PTEN低表达，而癌旁组织中高表达，差异均有显著性意义（P<0.05）。miR-32表达下调后，导致PTEN表达增高，提高miR-32表达后，PTEN蛋白水平下调。结论：miRNA-32和PTEN与宫颈癌发生发展有关，PTEN可能是miR-32的靶基因。
【关键词】 miRNA 宫颈癌 PTEN
Relationship between miR-32 and PTEN expexpression in cervical cancer
Wang Fang， Liu Juan， Zhang Xuan， Lei Taoxiang， Lu Wanggui， Luo Dixian， Tan Tan
Chenzhou First People's Hospital affiliated to University of South China 423000
【Abstract】 Objective： To investigate the relationship between miR-32 and PTEN expexpression in cervical cancer. Methods： miR-32 is detected by qRT-PCR， and PTEN is detedted by Western blot in cervical carcinoma and carcinoma adjacent tissues. To analyze the relationship between PTEN expression and cervical cancer. miR-32 mimics， inhibitors， negative control （NC）， transfected into Hela cells， the expression of miR-32 was detected by qRT-PCR， and the expression of PTEN was detected by Western blot. Results： miR-32 is high expression in cervical cancer tissues and low expression in carcinoma adjacent tissues. PTEN is low expression in cervical cancer tissues and high expression in carcinoma adjacent tissues. These differences were significant （P<0.05）. miR-32 downregulate in Hela-miR-32 inhibitors cell line and resulting in increasing of PTEN expression level. miR-32 upregulate in Hela-miR-32 mimics cell line and resulting in decreasing of PTEN expression level. Conclusions： There were relationship between expression of miR-32 and PTEN and development and progress of cervical cancer. PTEN may be the targeted gene of miR-32.
【Keywords】 miRNA， Cervical cancer， PTEN
宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤之一，晚期宫颈癌患者，由于容易出现的复发、转移和耐药，目前疗效并不理想[1]。PTEN是一种肿瘤抑制基因，在细胞生长、凋亡、迁移、浸润等方面有重要作用[2]。前期工作中，发现，miR-32与PTEN结合最稳定，特异性最好。本项目拟研究miR-32和PTEN在宫頸癌发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
鼠抗人单克隆PTEN、β-actin抗体，脂质体，美国Santa Cruz公司产品。Transwell试剂盒、Matrigel基质胶，美国B&D公司产品。
1.2 miR-32 mimics、NC及inhibitors
试剂均由广州博锐生物科技有限公司合成。
1.3 qRT-PCR
在实时荧光定量PCR仪上进行PCR反应。qRT-PCR反应体系如下： 10μM 正向引物1μl； 10μM反向引物1μL； DNA模板 2μL ； ddH2O 8.5μL； 2×SYBR Primix Ex TaqTMⅡ12.5μL； 总反应体系25μL。按以下过程进行：95℃，5 min；35个PCR循环（95℃，10sec；59℃，15sec；72℃，20sec；82℃，5sec）。
1.4 Western blot
：步骤如下：分别收集细胞约108个，抽提细胞的总蛋白；蛋白样品加热变性； SDS-PAGE电泳；转膜：电压设置为100V，时间约1h；丽春红溶液中染色3-5min；封闭1-2h；加入适量的封闭液和一抗（一抗浓度为1：1500）；再加封闭液和生物素进行标记的二抗（二抗浓度为1：1000），常温下孵育1-2h；压X光片，定影显影，洗片，图像扫描。 1.5 重组细胞系的建立
首先采用脂质体转染试剂盒（Lipofectamine 2000）将miR-32 mimics、NC及inhibitors序列分别通过脂质体方法转染宫颈癌Hela细胞系，获得三个重组细胞株：Hela-miR-32 mimics、Hela-miR-NC、Hela-miR-32- inhibitors。
1.6 统计学分析：采用SPSS18.0进行统计学分析，实验结果以均数±标准差表示，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 宫颈癌组织与癌旁组织中miR-32和PTEN表达关系
miR-32在宫颈癌组织中高表达，而在癌旁组织中低表达；PTEN在宫颈癌组织中低表达，在癌旁组织中高表达，差异有显著性意义（P<0.05，图1）。
A， miR-32相对表达水平；B， PTEN表达水平；C， PTEN相对灰度值。
*P<0.01，宫颈癌与癌旁组织比较。
2.2 miR-32与PTEN表达关系
Hela-miR-32 inhibitors细胞株中，miR-32表达水平下调后，导致PTEN表达水平增高；Hela-miR-32 mimics细胞株中，提高miR-32表达水平后，PTEN蛋白水平下调，差异均有显著性意义（P<0.05，图2）；而Hela和Hela-miR-NC比较，差异均无显著性意义。
A， miR-32相对水平； B， PTEN的水平
4 讨论
研究发现，PTEN 基因在宫颈组织从癌前病变向宫颈癌演变的过程中有重要作用； PTEN 基因的功能缺失使其对肿瘤细胞生长抑制及对细胞黏附的控制减弱，有助于宫颈癌的发生[3，4]。PTEN也可作为评价宫颈癌预后的指标[5]。本研究发现，宫颈癌组织中PTEN低表达，癌旁组织中高表达，两者之间的差异有统计学。PTEN与宫颈癌发生发展有关。
研究表明，miRNA的表达异常与宫颈癌的发生、发展有着直接的联系[6]。有研究发现，miRNA-27b 在宫颈癌中表达增高，下调miRNA-27b 表达水平后，宫颈癌细胞的生长受到明显抑制[7]。本研究发现：宫颈癌组织中出现同时miR-32高表达和PTEN低表达，而癌旁组织中同时出现miR-32低表达和PTEN高表达。说明miR-32与PTEN 表达均与宫颈癌发生发展相关，miR-32与PTEN 表达具有负相关。同时，宫颈癌细胞中，miR-32表达下调后，导致PTEN表达水平增高；而提高miR-32表达后，PTEN蛋白水平下调，结合前期工作在生物信息学分析，本研究认为PTEN可能是miR-32的下游靶基因。他们之间的靶向结合与宫颈癌的关系值得进一步研究。
参考文献
[1]李雪， 孔为民， 韩超， 等. 首都医科大学附属北京妇产医院1992-2011年间宫颈癌发病趋势分析 [J]. 中华妇幼临床医学杂志， 2013， 9（3）：310-314.
[2]Lokody IB， Francis JC， Gardiner JR， et al. Pten Regulates Epithelial Cytodifferentiation during Prostate Development [J]. PLoS One. 2015， 10（6）：e0129470.
[3]Xu J， Zhang W， Lv Q， et al. Overexpression of miR-21 promotes the proliferation and migration of cervical cancer cells via the inhibition of PTEN [J]. Oncol Rep. 2015， 33（6）：3108-3116.
[4]Qi Q， Ling Y， Zhu M， et al. Promoter region methylation and loss of protein expression of PTEN and significance in cervical cancer [J]. Biomed Rep. 2014， 2（5）：653-658.
[5]Loures LF， Candido EB， Vidigal PV， et al. PTEN expression in patients with carcinoma of the cervix and its association with p53， Ki-67 and CD31 [J]. Rev Bras Ginecol Obstet. 2014， 36（5）：205-210.
[6]He Y， Lin J， Ding Y， et al. A systematic study on dysregulated microRNAs in cervical cancer development [J]. Int J Cancer. 2016， 138（6）：1312-1327.
[7]Yao J， Deng B， Zheng L， et al. miR-27b is upregulated in cervical carcinogenesis and promotes cell growth and invasion by regulating CDH11 and epithelial-mesenchymal transition[J]. Oncol Rep. 2016， 35（3）：1645-1651.
作者簡介：王方（1983-02）土家族 湖南省慈利县 南华大学附属郴州市第一人民医院。本科，主治医师。研究方向：妇科肿瘤。
通讯作者：谭潭（1980-1月）， 男，汉族， 湖南省郴州市 南华大学附属郴州市第一人民医院，硕士学历，主管检验师，研究方向：肿瘤发病机制研究。
【关键词】 miRNA 宫颈癌 PTEN
Relationship between miR-32 and PTEN expexpression in cervical cancer
Wang Fang， Liu Juan， Zhang Xuan， Lei Taoxiang， Lu Wanggui， Luo Dixian， Tan Tan
Chenzhou First People's Hospital affiliated to University of South China 423000
【Abstract】 Objective： To investigate the relationship between miR-32 and PTEN expexpression in cervical cancer. Methods： miR-32 is detected by qRT-PCR， and PTEN is detedted by Western blot in cervical carcinoma and carcinoma adjacent tissues. To analyze the relationship between PTEN expression and cervical cancer. miR-32 mimics， inhibitors， negative control （NC）， transfected into Hela cells， the expression of miR-32 was detected by qRT-PCR， and the expression of PTEN was detected by Western blot. Results： miR-32 is high expression in cervical cancer tissues and low expression in carcinoma adjacent tissues. PTEN is low expression in cervical cancer tissues and high expression in carcinoma adjacent tissues. These differences were significant （P<0.05）. miR-32 downregulate in Hela-miR-32 inhibitors cell line and resulting in increasing of PTEN expression level. miR-32 upregulate in Hela-miR-32 mimics cell line and resulting in decreasing of PTEN expression level. Conclusions： There were relationship between expression of miR-32 and PTEN and development and progress of cervical cancer. PTEN may be the targeted gene of miR-32.
【Keywords】 miRNA， Cervical cancer， PTEN
宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤之一，晚期宫颈癌患者，由于容易出现的复发、转移和耐药，目前疗效并不理想[1]。PTEN是一种肿瘤抑制基因，在细胞生长、凋亡、迁移、浸润等方面有重要作用[2]。前期工作中，发现，miR-32与PTEN结合最稳定，特异性最好。本项目拟研究miR-32和PTEN在宫頸癌发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
鼠抗人单克隆PTEN、β-actin抗体，脂质体，美国Santa Cruz公司产品。Transwell试剂盒、Matrigel基质胶，美国B&D公司产品。
1.2 miR-32 mimics、NC及inhibitors
试剂均由广州博锐生物科技有限公司合成。
1.3 qRT-PCR
在实时荧光定量PCR仪上进行PCR反应。qRT-PCR反应体系如下： 10μM 正向引物1μl； 10μM反向引物1μL； DNA模板 2μL ； ddH2O 8.5μL； 2×SYBR Primix Ex TaqTMⅡ12.5μL； 总反应体系25μL。按以下过程进行：95℃，5 min；35个PCR循环（95℃，10sec；59℃，15sec；72℃，20sec；82℃，5sec）。
1.4 Western blot
：步骤如下：分别收集细胞约108个，抽提细胞的总蛋白；蛋白样品加热变性； SDS-PAGE电泳；转膜：电压设置为100V，时间约1h；丽春红溶液中染色3-5min；封闭1-2h；加入适量的封闭液和一抗（一抗浓度为1：1500）；再加封闭液和生物素进行标记的二抗（二抗浓度为1：1000），常温下孵育1-2h；压X光片，定影显影，洗片，图像扫描。 1.5 重组细胞系的建立
首先采用脂质体转染试剂盒（Lipofectamine 2000）将miR-32 mimics、NC及inhibitors序列分别通过脂质体方法转染宫颈癌Hela细胞系，获得三个重组细胞株：Hela-miR-32 mimics、Hela-miR-NC、Hela-miR-32- inhibitors。
1.6 统计学分析：采用SPSS18.0进行统计学分析，实验结果以均数±标准差表示，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 宫颈癌组织与癌旁组织中miR-32和PTEN表达关系
miR-32在宫颈癌组织中高表达，而在癌旁组织中低表达；PTEN在宫颈癌组织中低表达，在癌旁组织中高表达，差异有显著性意义（P<0.05，图1）。
A， miR-32相对表达水平；B， PTEN表达水平；C， PTEN相对灰度值。
*P<0.01，宫颈癌与癌旁组织比较。
2.2 miR-32与PTEN表达关系
Hela-miR-32 inhibitors细胞株中，miR-32表达水平下调后，导致PTEN表达水平增高；Hela-miR-32 mimics细胞株中，提高miR-32表达水平后，PTEN蛋白水平下调，差异均有显著性意义（P<0.05，图2）；而Hela和Hela-miR-NC比较，差异均无显著性意义。
A， miR-32相对水平； B， PTEN的水平
4 讨论
研究发现，PTEN 基因在宫颈组织从癌前病变向宫颈癌演变的过程中有重要作用； PTEN 基因的功能缺失使其对肿瘤细胞生长抑制及对细胞黏附的控制减弱，有助于宫颈癌的发生[3，4]。PTEN也可作为评价宫颈癌预后的指标[5]。本研究发现，宫颈癌组织中PTEN低表达，癌旁组织中高表达，两者之间的差异有统计学。PTEN与宫颈癌发生发展有关。
研究表明，miRNA的表达异常与宫颈癌的发生、发展有着直接的联系[6]。有研究发现，miRNA-27b 在宫颈癌中表达增高，下调miRNA-27b 表达水平后，宫颈癌细胞的生长受到明显抑制[7]。本研究发现：宫颈癌组织中出现同时miR-32高表达和PTEN低表达，而癌旁组织中同时出现miR-32低表达和PTEN高表达。说明miR-32与PTEN 表达均与宫颈癌发生发展相关，miR-32与PTEN 表达具有负相关。同时，宫颈癌细胞中，miR-32表达下调后，导致PTEN表达水平增高；而提高miR-32表达后，PTEN蛋白水平下调，结合前期工作在生物信息学分析，本研究认为PTEN可能是miR-32的下游靶基因。他们之间的靶向结合与宫颈癌的关系值得进一步研究。
参考文献
[1]李雪， 孔为民， 韩超， 等. 首都医科大学附属北京妇产医院1992-2011年间宫颈癌发病趋势分析 [J]. 中华妇幼临床医学杂志， 2013， 9（3）：310-314.
[2]Lokody IB， Francis JC， Gardiner JR， et al. Pten Regulates Epithelial Cytodifferentiation during Prostate Development [J]. PLoS One. 2015， 10（6）：e0129470.
[3]Xu J， Zhang W， Lv Q， et al. Overexpression of miR-21 promotes the proliferation and migration of cervical cancer cells via the inhibition of PTEN [J]. Oncol Rep. 2015， 33（6）：3108-3116.
[4]Qi Q， Ling Y， Zhu M， et al. Promoter region methylation and loss of protein expression of PTEN and significance in cervical cancer [J]. Biomed Rep. 2014， 2（5）：653-658.
[5]Loures LF， Candido EB， Vidigal PV， et al. PTEN expression in patients with carcinoma of the cervix and its association with p53， Ki-67 and CD31 [J]. Rev Bras Ginecol Obstet. 2014， 36（5）：205-210.
[6]He Y， Lin J， Ding Y， et al. A systematic study on dysregulated microRNAs in cervical cancer development [J]. Int J Cancer. 2016， 138（6）：1312-1327.
[7]Yao J， Deng B， Zheng L， et al. miR-27b is upregulated in cervical carcinogenesis and promotes cell growth and invasion by regulating CDH11 and epithelial-mesenchymal transition[J]. Oncol Rep. 2016， 35（3）：1645-1651.
作者簡介：王方（1983-02）土家族 湖南省慈利县 南华大学附属郴州市第一人民医院。本科，主治医师。研究方向：妇科肿瘤。
通讯作者：谭潭（1980-1月）， 男，汉族， 湖南省郴州市 南华大学附属郴州市第一人民医院，硕士学历，主管检验师，研究方向：肿瘤发病机制研究。