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摘要[目的]了解草鱼♀×鳡♂杂交F1代的生化遗传特性。[方法]应用聚丙烯酸胺凝胶垂直板电泳技术，对草鳡杂交F1代的9种组织（心、脑、眼、肝、肾、脾、鳍、肌肉、血浆）的3种同工酶（LDH 、EST、MDH）进行了分析，同时比较了其同工酶及蛋白质与亲本草鱼、鳡的差异。[结果]草鳡杂交F1代的3种同工酶具有不同程度的组织特异性，其同工酶和蛋白质与亲本之间存在明显差异。[结论]这些差异可作为鉴别草鳡杂交鱼及亲本的标志。
关键词 草鱼；鳡；杂交F1；同工酶；蛋白质
中图分类号S965.112文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10573-03
基金项目武汉市科技计划项目（2013021001010464）。
作者简介余来宁（1948- ），男，湖北武汉人，教授，博士生导师，从事鱼类遗传育种研究。
杂交育种是农业上常用的培育新品种的主要方法之一。草鱼（Ctenopharyngodon idellus）和鳡（Elopichthys bambusa）同属鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科，分属草鱼属和鳡属。二者许多性状存在优势互补。近年来，笔者进行了草鱼♀×鳡♂属间杂交试验，经观察发现草鱼♀×鳡♂杂交F1代（简称草鳡杂交F1代）外形上与草鱼相似，在生长上和抗病性等方面表现出一定的杂交优势[1]。为了进一步开展草鳡杂交后代的选育，摸清草鳡杂交F1代的遗传性状十分必要。
同工酶电泳分析方法是从遗传学角度研究杂交后代的生化表型变异及组织特异性的重要手段。笔者应用聚丙烯酸胺垂直板电泳技术对草鳡杂交F1代的同工酶和蛋白质进行了电泳分析，并与亲本草鱼、鳡进行了比较，旨在了解草鳡杂交F1代的生化遗传特性，同时为寻找鉴别草鳡杂交F1代的生化遗传标志，并为草鳡杂交育种积累资料。
1材料与方法
1.1材料来源试验所用草鱼、鳡及草鳡杂交F1代鱼均为1+龄鱼，来源于武汉江夏区鲁湖渔场和江汉大学生命科学学院鱼池。每种鱼取7～10尾， （草鱼体长161～185 mm；鳡体长336～375 mm；草鳡杂交F1代鱼体长202～237 mm）。
1.2样品制备每尾鱼先用浓度100 mg/L的MS-222麻醉，使用一次性注射器从鱼尾静脉抽血0.2 ml，放入预先盛有2 ml含0.1%肝素的生理盐水的离心管中，用KDC-40型离心机（国产），以1 500 r/min离心8 min，取上清液血浆置于4 ℃冰箱备用，并收集离心管下部的红血球，用生理盐水洗涤2次。加入红血球体积2倍的无离子水，低渗振荡破碎红血球。然后，以3 000 r/min的转速离心30 min，取红色透明的上清液（含血红蛋白Hb）置于4 ℃冰箱备用。
将采血后的鱼立即解剖，取心、脑、眼、肝、肾、脾、肌、鳍等组织，称取0.2 g，加入10倍的磷酸缓冲液（0.01 mol/L，pH7.4），使用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆。然后，以3 000 r/min的转速离心30 min。取上清液置于冰箱中保存备用。
1.3电泳和染色采用聚丙烯酰胺垂直板连续系统电泳（pH8.9，仅有分离胶，无浓缩胶），使用JYSCZ2型电泳槽，分析同工酶的凝胶浓度为8%，分析蛋白质的凝胶浓度为10%。电泳和染色方法参照《遗传学实验方法和技术》[2]及有关文献[3-5]，并稍有改进：将电泳槽放在冰浴中进行电泳。
1.4酶谱带型表示方法将同一种酶电泳图谱上的所有条带按照迁移率快慢依次编号，泳道样品的带型，以其拥有的条带号组成，并按染色深浅（活性大小）由左至右排序。将此方法称为带型码。例如，LDH共有7条带，按迁移率快慢依次编号为1、2、3、4、5、6、7。其中，肝脏（L）有5条带，其带号为12456（缺3号带），再将带号按染色深浅排序，肝脏（L泳道）第5条带染色最深，就排在左侧第1位；染色次深的是第6条带，就排在左第2位。因此肝脏带型应为56124。眼（E）和脑（B）均有5条带，带号均为12345，看不出区别，但按染色深浅排序后则分别为15234和23451，就可以反映出2个样品的谱带及活性差异。若要精确确定条带染色深浅（活性大小），可用BandScan或Quantity One 等软件分析确定次序。另外，还可以在带型码前面加上代表组织的字母，如脑（代号是B）其带型码可写为B23451。此方法同样适用于蛋白质的电泳分析。
2结果与分析
2.1草鳡杂交F1代不同组织的同工酶分析
2.1.1乳酸脱氢酶（LDH 1. 1. 1. 27）。乳酸脱氢酶为四聚体酶，一般由LDHA，LDHB 2基因位点控制。在许多种鱼类中还存在LDHC基因。草鳡杂交F1代的LDH同工酶共有7条酶带（图1）， 由LDHA 和LDHB 亚基组合而成的5条酶带从正极到负极分别为B4、A1B3、A2B2，A3B1 A4，在9种组织中都有表达；箭头所指的第6条酶带（C4）是由LDHC基因编码，仅在肝脏酶谱中表达。在血浆中靠近负极有一条很细的酶带，其遗传背景还不清楚，暂定为LDHX。草鳡杂交F1代LDH同工酶活性具有组织特异性，LDH同工酶在肌肉中活性强，LDHB4在脾脏中优势表达而在肝脏中表达较弱，LDHA4在肝脏、肌肉、血浆中优势表达，但肝脏中缺乏同工酶A2B2。这种组织特异性与相应的生理功能有关。用带型码表示9种组织的LDH酶谱带型即分别为S51234、K15234、L56124、M51423、E15234、B23451、H52134、P56312、F35412。通过带型码可以看出，9种组织LDH同工酶条带完全不同，说明草鳡杂交F1代LDH具有明显的组织特异性。
2.1.2酯酶（EST 3 .1. 1. 1）。鱼类酯酶一般为单体或二聚体，由多个基因座位控制。在草鳡杂交F1代的9种组织中有7种表达EST同工酶，在肌肉和眼中没有发现酶带。电泳图谱共观察到3条酶带（图2）。为了便于与鳡进行比较，按迁移率快慢依次编为EST2、EST3、EST4（鳡有EST1带）。酯酶在草鳡杂交F1代的肝脏，肾脏、血浆中活性很高，但在血浆中仅有EST2这一条酶带。EST2、EST 3和EST4在鳍条、肝脏和肾脏中均有表达，而在脾脏、心脏和脑中EST2不表达，具有明显的组织特异性。 2.1.3苹果酸脱氢酶（MDH 1.1. 1. 37）。苹果酸脱氢酶具有上清液型（s-MDH）和线粒体型（m-MDH）2种类型，分别由2个基因位点控制，为二聚体。草鳡杂交F1代不同组织中的MDH共有9条带（图3），s-MDH有3条带，仅在肌肉、眼晶体、鳍和血浆中表达；m-MDH有6条带，在除血浆外的其他8种组织中表达。草鳡杂交F1代MDH组织特异性非常明显，9种组织呈9种带型，完全不同。
2.2草鳡杂交F1代与亲本草鱼、鳡的同工酶比较
2.2.1LDH比较。以草鳡杂交F1代的鳍条、血浆与亲本进行LDH同工酶分析比较。从图4可以看出，草鳡杂交F1代与亲本草鱼、鳡之间存在明显差异，在血浆中都有LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5 5条酶带，而F1代还多1条LDH6，是双亲所没有的酶带（见图中箭头所指），显然这是由杂交产生的新带。在肝脏中F1代有5条带，而草鱼只有2条带，鳡有6条带，存在明显差异。
2.2.2EST比较。从图5可以看出草鳡杂交F1代与亲本鳍条的EST电泳图谱差异显著，F1代EST电泳图谱有3条带，其中EST2、EST3条带与草鱼相同，但比草鱼多1条带EST4，这条带与鳡相同，显然是杂交中由鳡提供的基因。草鱼与鳡二者之间差异很大，没有共同的酶带，前者有EST2、EST3条带，而后者有EST1、EST4条带。
2.3草鳡杂交F1代与亲本草鱼、鳡蛋白质的电泳比较
2.3.1血红蛋白（Hb）电泳比较。从图7可以看出，F1代Hb有4条带，其中有3条带（Hb1、Hb2、Hb3）与草鱼相同，但多1条杂交带Hb4，是双亲所没有的条带，而鳡只有Hb3条带，三者之间差异非常明显。
2.3.2蛋白质电泳比较。从图8可以看出，F1代与亲本三者之间存在诸多差异。F1代血浆蛋白质有4条带，草鱼有7条带，鳡有6条带。血浆中，F1代在47.9 kD处有1条杂交蛋白带；肌肉中，F1代在78.5和24.8 kD处各有1条杂交蛋白带。鳍条中，F1代在44.1 kD处有1条杂交蛋白带（图中箭头处）。F1代与亲本的3种蛋白质的带型都不同，差异明显。
3讨论
从草鳡杂交F1代9种组织的3种同工酶电泳分析结果来看，草鳡杂草F1代各组织的同工酶表达存在明显的组织特异性。F1代肝脏LDH与其他组织差异很大，多1条C4带，但草鱼肝脏无C4带，而鳡有C4带，说明LDHC基因表达与种类有关，草鳡杂交F1代的LDHC基因是由鳡提供的。F1代的MDH同工酶9种组织的酶谱都不同，说明MDH是十分活跃的同工酶，根据各组织的不同功能需求而表达。F1代的EST同工酶，虽然带型比较简单，但组织特异性仍十分明显，主要表现在表达与否及活性强度上，EST在F1代的肝脏、肾脏和血浆中活性很高，但在脑组织中极弱，甚至在眼和肌肉不表达。组织中的同工酶差异与器官的不同生理功能有关，同时也是基因调控的结果，基因调控使必需基因开放，使不必要的基因关闭[6-7]，在同工酶电泳凝胶酶带上表现出有或无。因此，同工酶分析是直观了解基因表达和调控情况的重要手段。
通过同工酶和蛋白质电泳的比较分析，笔者已发现了F1代与草鱼、鳡之间的差异可作为鉴别这3种鱼的生化标志。从电泳图谱可以看出这些差异，但用文字描述却很难说清楚。为了简明扼要说明这些差异，现用带型码描述图谱带型，比较其差异，归纳于表1。
关键词 草鱼；鳡；杂交F1；同工酶；蛋白质
中图分类号S965.112文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10573-03
基金项目武汉市科技计划项目（2013021001010464）。
作者简介余来宁（1948- ），男，湖北武汉人，教授，博士生导师，从事鱼类遗传育种研究。
杂交育种是农业上常用的培育新品种的主要方法之一。草鱼（Ctenopharyngodon idellus）和鳡（Elopichthys bambusa）同属鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科，分属草鱼属和鳡属。二者许多性状存在优势互补。近年来，笔者进行了草鱼♀×鳡♂属间杂交试验，经观察发现草鱼♀×鳡♂杂交F1代（简称草鳡杂交F1代）外形上与草鱼相似，在生长上和抗病性等方面表现出一定的杂交优势[1]。为了进一步开展草鳡杂交后代的选育，摸清草鳡杂交F1代的遗传性状十分必要。
同工酶电泳分析方法是从遗传学角度研究杂交后代的生化表型变异及组织特异性的重要手段。笔者应用聚丙烯酸胺垂直板电泳技术对草鳡杂交F1代的同工酶和蛋白质进行了电泳分析，并与亲本草鱼、鳡进行了比较，旨在了解草鳡杂交F1代的生化遗传特性，同时为寻找鉴别草鳡杂交F1代的生化遗传标志，并为草鳡杂交育种积累资料。
1材料与方法
1.1材料来源试验所用草鱼、鳡及草鳡杂交F1代鱼均为1+龄鱼，来源于武汉江夏区鲁湖渔场和江汉大学生命科学学院鱼池。每种鱼取7～10尾， （草鱼体长161～185 mm；鳡体长336～375 mm；草鳡杂交F1代鱼体长202～237 mm）。
1.2样品制备每尾鱼先用浓度100 mg/L的MS-222麻醉，使用一次性注射器从鱼尾静脉抽血0.2 ml，放入预先盛有2 ml含0.1%肝素的生理盐水的离心管中，用KDC-40型离心机（国产），以1 500 r/min离心8 min，取上清液血浆置于4 ℃冰箱备用，并收集离心管下部的红血球，用生理盐水洗涤2次。加入红血球体积2倍的无离子水，低渗振荡破碎红血球。然后，以3 000 r/min的转速离心30 min，取红色透明的上清液（含血红蛋白Hb）置于4 ℃冰箱备用。
将采血后的鱼立即解剖，取心、脑、眼、肝、肾、脾、肌、鳍等组织，称取0.2 g，加入10倍的磷酸缓冲液（0.01 mol/L，pH7.4），使用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆。然后，以3 000 r/min的转速离心30 min。取上清液置于冰箱中保存备用。
1.3电泳和染色采用聚丙烯酰胺垂直板连续系统电泳（pH8.9，仅有分离胶，无浓缩胶），使用JYSCZ2型电泳槽，分析同工酶的凝胶浓度为8%，分析蛋白质的凝胶浓度为10%。电泳和染色方法参照《遗传学实验方法和技术》[2]及有关文献[3-5]，并稍有改进：将电泳槽放在冰浴中进行电泳。
1.4酶谱带型表示方法将同一种酶电泳图谱上的所有条带按照迁移率快慢依次编号，泳道样品的带型，以其拥有的条带号组成，并按染色深浅（活性大小）由左至右排序。将此方法称为带型码。例如，LDH共有7条带，按迁移率快慢依次编号为1、2、3、4、5、6、7。其中，肝脏（L）有5条带，其带号为12456（缺3号带），再将带号按染色深浅排序，肝脏（L泳道）第5条带染色最深，就排在左侧第1位；染色次深的是第6条带，就排在左第2位。因此肝脏带型应为56124。眼（E）和脑（B）均有5条带，带号均为12345，看不出区别，但按染色深浅排序后则分别为15234和23451，就可以反映出2个样品的谱带及活性差异。若要精确确定条带染色深浅（活性大小），可用BandScan或Quantity One 等软件分析确定次序。另外，还可以在带型码前面加上代表组织的字母，如脑（代号是B）其带型码可写为B23451。此方法同样适用于蛋白质的电泳分析。
2结果与分析
2.1草鳡杂交F1代不同组织的同工酶分析
2.1.1乳酸脱氢酶（LDH 1. 1. 1. 27）。乳酸脱氢酶为四聚体酶，一般由LDHA，LDHB 2基因位点控制。在许多种鱼类中还存在LDHC基因。草鳡杂交F1代的LDH同工酶共有7条酶带（图1）， 由LDHA 和LDHB 亚基组合而成的5条酶带从正极到负极分别为B4、A1B3、A2B2，A3B1 A4，在9种组织中都有表达；箭头所指的第6条酶带（C4）是由LDHC基因编码，仅在肝脏酶谱中表达。在血浆中靠近负极有一条很细的酶带，其遗传背景还不清楚，暂定为LDHX。草鳡杂交F1代LDH同工酶活性具有组织特异性，LDH同工酶在肌肉中活性强，LDHB4在脾脏中优势表达而在肝脏中表达较弱，LDHA4在肝脏、肌肉、血浆中优势表达，但肝脏中缺乏同工酶A2B2。这种组织特异性与相应的生理功能有关。用带型码表示9种组织的LDH酶谱带型即分别为S51234、K15234、L56124、M51423、E15234、B23451、H52134、P56312、F35412。通过带型码可以看出，9种组织LDH同工酶条带完全不同，说明草鳡杂交F1代LDH具有明显的组织特异性。
2.1.2酯酶（EST 3 .1. 1. 1）。鱼类酯酶一般为单体或二聚体，由多个基因座位控制。在草鳡杂交F1代的9种组织中有7种表达EST同工酶，在肌肉和眼中没有发现酶带。电泳图谱共观察到3条酶带（图2）。为了便于与鳡进行比较，按迁移率快慢依次编为EST2、EST3、EST4（鳡有EST1带）。酯酶在草鳡杂交F1代的肝脏，肾脏、血浆中活性很高，但在血浆中仅有EST2这一条酶带。EST2、EST 3和EST4在鳍条、肝脏和肾脏中均有表达，而在脾脏、心脏和脑中EST2不表达，具有明显的组织特异性。 2.1.3苹果酸脱氢酶（MDH 1.1. 1. 37）。苹果酸脱氢酶具有上清液型（s-MDH）和线粒体型（m-MDH）2种类型，分别由2个基因位点控制，为二聚体。草鳡杂交F1代不同组织中的MDH共有9条带（图3），s-MDH有3条带，仅在肌肉、眼晶体、鳍和血浆中表达；m-MDH有6条带，在除血浆外的其他8种组织中表达。草鳡杂交F1代MDH组织特异性非常明显，9种组织呈9种带型，完全不同。
2.2草鳡杂交F1代与亲本草鱼、鳡的同工酶比较
2.2.1LDH比较。以草鳡杂交F1代的鳍条、血浆与亲本进行LDH同工酶分析比较。从图4可以看出，草鳡杂交F1代与亲本草鱼、鳡之间存在明显差异，在血浆中都有LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5 5条酶带，而F1代还多1条LDH6，是双亲所没有的酶带（见图中箭头所指），显然这是由杂交产生的新带。在肝脏中F1代有5条带，而草鱼只有2条带，鳡有6条带，存在明显差异。
2.2.2EST比较。从图5可以看出草鳡杂交F1代与亲本鳍条的EST电泳图谱差异显著，F1代EST电泳图谱有3条带，其中EST2、EST3条带与草鱼相同，但比草鱼多1条带EST4，这条带与鳡相同，显然是杂交中由鳡提供的基因。草鱼与鳡二者之间差异很大，没有共同的酶带，前者有EST2、EST3条带，而后者有EST1、EST4条带。
2.3草鳡杂交F1代与亲本草鱼、鳡蛋白质的电泳比较
2.3.1血红蛋白（Hb）电泳比较。从图7可以看出，F1代Hb有4条带，其中有3条带（Hb1、Hb2、Hb3）与草鱼相同，但多1条杂交带Hb4，是双亲所没有的条带，而鳡只有Hb3条带，三者之间差异非常明显。
2.3.2蛋白质电泳比较。从图8可以看出，F1代与亲本三者之间存在诸多差异。F1代血浆蛋白质有4条带，草鱼有7条带，鳡有6条带。血浆中，F1代在47.9 kD处有1条杂交蛋白带；肌肉中，F1代在78.5和24.8 kD处各有1条杂交蛋白带。鳍条中，F1代在44.1 kD处有1条杂交蛋白带（图中箭头处）。F1代与亲本的3种蛋白质的带型都不同，差异明显。
3讨论
从草鳡杂交F1代9种组织的3种同工酶电泳分析结果来看，草鳡杂草F1代各组织的同工酶表达存在明显的组织特异性。F1代肝脏LDH与其他组织差异很大，多1条C4带，但草鱼肝脏无C4带，而鳡有C4带，说明LDHC基因表达与种类有关，草鳡杂交F1代的LDHC基因是由鳡提供的。F1代的MDH同工酶9种组织的酶谱都不同，说明MDH是十分活跃的同工酶，根据各组织的不同功能需求而表达。F1代的EST同工酶，虽然带型比较简单，但组织特异性仍十分明显，主要表现在表达与否及活性强度上，EST在F1代的肝脏、肾脏和血浆中活性很高，但在脑组织中极弱，甚至在眼和肌肉不表达。组织中的同工酶差异与器官的不同生理功能有关，同时也是基因调控的结果，基因调控使必需基因开放，使不必要的基因关闭[6-7]，在同工酶电泳凝胶酶带上表现出有或无。因此，同工酶分析是直观了解基因表达和调控情况的重要手段。
通过同工酶和蛋白质电泳的比较分析，笔者已发现了F1代与草鱼、鳡之间的差异可作为鉴别这3种鱼的生化标志。从电泳图谱可以看出这些差异，但用文字描述却很难说清楚。为了简明扼要说明这些差异，现用带型码描述图谱带型，比较其差异，归纳于表1。