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摘要动物和植物Argonaute蛋白在RNA诱导的基因沉默中发挥重要作用。本研究采用生物信息学方法在全基因组水平鉴定短管赤眼蜂Argonaute蛋白基因家族，鉴定并命名6个TpAGO蛋白。蛋白结构及系统进化分析将TpAGO家族蛋白分为PIWI和Ago两个亚家族。TpAGO蛋白二级结构的数量比例差异不大，分布却存在一定差异，其中α螺旋分布差异尤为显著。TpAGO蛋白基因结构表现明显的多样性，基因外显子数量差异明显，从1到20个数量不等；Ka/Ks分析表明TpAGO2和TpAGO5，TpAGO3和TpAGO4两对基因间进化动力为正选择作用，其他组合间表现为纯化选择。EST表达分析发现TpAGO基因在昆虫的卵期、幼虫期、蛹期和成虫期均有不同程度的表达，而且靶向EST在同一物种中具有单一性别（雌性或雄性）表达特性，表明短管赤眼蜂TpAGO蛋白基因可参与赤眼蜂性别及发育调控。该研究不仅有助于揭示赤眼蜂产雌孤雌生殖的表观遗传机理，也有助于推动赤眼蜂等天敌的生防应用。
关键词 短管赤眼蜂；Argonaute；基因家族；生物信息学
中图分类号： S 476.3
文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.06.006
Identification and expression analysis of Argonaute protein gene
family in Trichogramma pretiosum
Yang Zhiqiang，Wang Liyan，Liang Hongyu，Liu Xu，Bai Xueping，Zhao Changjiang，Zhang Haiyan
（College of Agronomy，Key Laboratory of Crop Germplasm Improvement and Cultivation in Cold Regions of Heilongjiang
Provincial HigherEducation Institutions，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing163319， China）
Abstract
The Argonaute family play an important role in gene silencing of RNA induction in plants and animals. Six Argonaute proteins were identified and named in genomewide level in Trichogramma pretiosum by using the bioinformatics methods. Analysis results of protein structure and phylogenetic analysis showed that TpAGO family proteins were divided into two subgroups， PIWI and Ago， and the numbers of secondary structures of TpAGO protein were similar， while the distribution was different among TpAGOs， especially the helix structure was differently distributed. The gene structure of TpAGOs showed obvious diversity， and the exon numbers varied significantly， ranging from 1 to 20. The evolutionary powers of two pairs of genes were positive selection， including TpAGO2 and TpAGO5， TpAGO3 and TpAGO4， and other combinations were driven by purification options. Expressional profiles by ESTs showed that TpAGO was expressed in different developmental stages， including egg， larval， pupal and adult stages， and worked in single gender （female or male） in the same species， which suggested that TpAGOs were involved in sex and development regulation of T.pretiosum. This research helps to reveal the genetic mechanism of thelytoky pattern and promote the biocontrol application of Trichogramma.
Key words
Trichogramma pretiosum；Argonaute；gene family；bioinformatics analysis
害蟲生物防治是有害生物治理中最成功、最节约和环境安全的方法。理论研究的核心是明确各类天敌的特性及其对害虫的控制功能，以及天敌和害虫之间相互作用规律[1]。赤眼蜂属膜翅目，是一种卵寄生性天敌昆虫，目前已成为害虫生物防治中应用最多，范围最广的害虫天敌之一。其中，感染共生菌Wolbachia的赤眼蜂具有更好的应用前景，因其营产雌孤雌生殖方式致使赤眼蜂后代完全为雌性，同比大大提高了天敌赤眼蜂的寄生能力，即有效增强了天敌对害虫的控制能力，提高了生物防治效果。尽管已有大量研究表明，赤眼蜂的产雌孤雌生殖方式是由Wolbachia感染所决定的[24]，但是Wolbachia与赤眼蜂互作调控产雌孤雌生殖的分子机理至今未见明确报道。 MicroRNAs（miRNA）是内源非编码小RNA，在细胞生物学过程中发挥重要的调控作用，涉及发育、分化、凋亡和免疫等过程，值得一提的是，miRNA也参与Wolbachia与宿主互作调控[5]。那么，小RNA沉默复合体（RNAinduced silencing complex，RISC）的重要组成部分Argonaute蛋白（Argonaute protein）在Wolbachia与宿主互作中的功能如何？Argonaute 蛋白是一个高度保守的家族，含有PIWI和PAZ两个共同的结构域，存在于绝大部分真核生物中。Argonaute蛋白在各个物种间的数量差距很大，其中人类Homo sapiens含有8种[6]，拟南芥Arabidopsis thaliana中有10种[7]、果蝇 Drosophila melanogaster中有 5种、家蚕Bombyx mori 4种[8]，秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans 27种[9]。但是，迄今为止，关于赤眼蜂Argonaute蛋白及其功能研究尚未见报道。
本研究利用生物信息学方法，在短管赤眼蜂Trichogramma pretiosum基因组水平分离鉴定Argonaute蛋白基因，在对基因结构、蛋白结构和系统进化分析的同时，进行了基于EST的表达谱分析，探讨Argonaute蛋白基因的功能。该研究有助于揭示Argonaute蛋白及其协调小RNA途径在赤眼蜂生长发育和性别调控中的作用，为在表观遗传学水平解析赤眼蜂产雌孤雌生殖机理奠定理论基础。
1材料与方法
1.1基因家族成员鉴定
利用已发表的家蚕、果蝇Argonaute蛋白序列为种子序列，通过BLASTp在NCBI数据库（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索短管赤眼蜂基因组（JARR00000000.1）；同时，以蛋白保守结构域PIWI和PAZ为种子在NCBI数据库搜索短管赤眼蜂基因组，分离鉴定短管赤眼蜂Argonaute蛋白。然后，使用BioEdit软件构建本地数据库，对上述两种方法获得的短管赤眼蜂Argonaute蛋白进行筛选去冗余并命名TpAGO。采用Expasy（http：∥web.expasy.org/protparam/）分析蛋白分子式、分子量和等电点等数据；采用WoLF PSORT（http：∥www.genscript.com/tools/wolfpsort）对蛋白进行亚细胞定位预测。
1.2氨基酸比对及系统进化树的构建
使用DNAMAN对短管赤眼蜂TpAGO蛋白进行比对作图；使用MEGA7.0对不同昆虫AGO蛋白采用邻接法比对并生成系统进化树，进行1 000次Bootstrap检验。
1.3蛋白高级结构分析
利用SOPMA 在线分析软件（https：∥npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分析蛋白二级结构；使用Expasy（https：∥swissmodel.expasy.org/interactive）分析蛋白三級结构。
1.4基因结构分析
短管赤眼蜂TpAGO全长基因提交GSDS软件（http：∥gsds.cbi.pku.edu.cn/）绘制基因结构图。
1.5碱基替换率分析
将短管赤眼蜂的TpAGO基因的编码区（去终止子）通过MEGA7.0的ClustalW比对，然后使用DNAsp软件计算TpAGO基因的非同义替换率Ka、同义替换率Ks以及他们的比值（Ka/Ks）。
1.6基因表达分析
使用短管赤眼蜂TpAGO基因编码序列在NCBI的EST数据库进行BLASTn分析；同时使用TpAGO氨基酸序列在NCBI的EST数据库进行tBLASTn分析，获得TpAGO基因的EST表达数据。
2结果与分析
2.1短管赤眼蜂TpAGO蛋白基因的鉴定
通过两种方法共获得191条序列，一方面采用DNAMAN进行序列分析，去除冗余序列，另一方面利用NCBI数据库对候选蛋白进行结构域分析，最终获得6个非冗余的短管赤眼蜂AGO蛋白，分别命名为TpAGO1至TpAGO6（表1）。TpAGO蛋白编码基因长度介于2 364 bp（TpAGO2.1）至3 144 bp（TpAGO4）之间。其中，4个TpAGO蛋白预测为细胞质或细胞核定位，包括TpAGO1、TpAGO2、TpAGO3和TpAGO4；2个TpAGO蛋白预测为线粒体或细胞核定位，分别为TpAGO5和TpAGO6。
2.2短管赤眼蜂AGO蛋白结构与系统进化分析
使用DNAMAN对鉴定获得的6种TpAGO蛋白进行结构域分析，均具有ArgoN、PAZ和PIWI保守结构域，氨基酸组成变异较大（图1）。通过邻接法对鉴定的6个短管赤眼蜂、4个家蚕、5个黑腹果蝇、3个丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis的Argonaute蛋白氨基酸序列进行比对构建系统进化树（图2）。通过系统进化分析发现，供试的18个Argonaute蛋白可分为两大亚家族，分别为Ago亚家族和PIWI亚家族。PIWI亚家族蛋白涵盖4个物种的10个成员，含有典型的PAZ、PIWI和ArgoN结构域，包括短管赤眼蜂TpAGO1、TpAGO2和TpAGO3，果蝇DmPIWI、DmAUB和DmAGO3，家蚕BmPIWI、BmAGO3，丽蝇蛹集金小蜂NvAUB和NvAGO3。其中，短管赤眼蜂TpAGO1和TpAGO2与NvAUB、DmPIWI和DmAUB、BmPIWI亲缘关系较近，TpAGO3与NvAGO3、DmAGO3和BmAGO3亲缘关系较近。Ago亚家族蛋白涵盖4个物种的8个成员，含有典型的PAZ、PIWI、ArgoN和Argol1结构域（图1），包括短管赤眼蜂TpAGO4、TpAGO5和TpAGO6，果蝇DmAGO1和DmAGO2，家蚕BmAGO1和BmAGO2，丽蝇蛹集金小蜂。其中，短管赤眼蜂TpAGO5和TpAGO6与DmAGO1和BmAGO1亲缘关系较近；TpAGO4与NvAGO2、DmAGO2和BmAGO2亲缘关系较近。 2.3短管赤眼蜂TpAGO基因结构与进化动力分析
对6个短管赤眼蜂TpAGO基因结构进行分析（图3）发现，AGO蛋白基因结构表现明显的多样性，基因外显子数量差异明显，从1到20个数量不等，与蛋白氨基酸结构和亚家族分类无明显对应关系。其中，TpAGO1含有10个外显子，TpAGO2有8个外显子，TpAGO3含有11个外显子，TpAGO4含有20个外显子， TpAGO6只有1个外显子。值得注意的是TpAGO5含有12个外显子，且内含子跨度较大，最大内含子跨度为32 623 bp，而且内含子中间有许多未知序列，该基因结构或基因组序列需进一步确证。此外6个TpAGO基因终止密码子也不完全相同，除TpAGO6终止密码子为tag外，其余5个TpAGO基因的终止子均为taa。
另外，通过对短管赤眼蜂TpAGO基因编码区序列碱基替代率分析（表2）发现，Ka/Ks比值高于1的组合有TpAGO2和TpAGO5，TpAGO3和TpAGO4，表明这两对基因间（或者两对基因所在两个亚家族间）进化动力为正选择作用。其他组合的Ka/Ks比值均小于1，表现为纯化选择。但是AGO基因家族成员间Ka/Ks比值整体较高，最低的为0.732 1，表明该家族基因可能经受较大的选择压力，可能与基因结构的多样性有一定关联。
2.4短管赤眼蜂TpAGO蛋白高级结构分析
通过软件对6个TpAGO蛋白的二级和三级结构进行分析（表3，图4，5），4种二级结构α螺旋、延伸链、β折叠和无规则卷曲在AGO蛋白间数量比例差异不大，分布却存在一定差异（图4），但是AGO蛋白的三级结构基本相似（图5），相差不大。供试的6个AGO蛋白中α螺旋氨基酸数量比例在28.37%～40.64%之间；延伸链的氨基酸数量比例在17.86%～25.16%之间；β折叠的氨基酸数量比例在7.59%～10.29%之间；无规则卷曲的氨基酸数量比例在30.07%～44.70%之间。而且，均以α螺旋和无规则卷曲两种二级结构为主。其中，α螺旋分布在AGO蛋白间存在一定差异（图4），PIWI亚家族蛋白（TpAGO1、TpAGO2和TpAGO3）的N端α螺旋分布明显高于Ago亚家族蛋白（TpAGO4、TpAGO5和TpAGO6）。上述结构分析结果与蛋白进化存在明显的相关性，表明两个亚家族成员在功能进化上存在一定分歧。
2.5短管赤眼蜂TpAGO基因在发育阶段的表达
通过TpAGO基因在NCBI的EST数据库比对分析，EST靶向序列以BLASTn比对中E值小于2e13或tBLASTn比对中E值小于1e67为标准，获得短管赤眼蜂TpAGO基因表达信息（表4），结果表明TpAGO基因在昆虫的卵期、幼虫期、蛹期和成虫期均有不同程度的表达，而且靶向EST在同一物种中具有单一性别（雌性或雄性）表达特性。其中TpAGO1基因靶向EST来源包括丽蝇蛹集金小蜂雄性蛹，埃及伊蚊Aedes aegypti雌成虫，拟果蝇雌成虫，褐飞虱Nilaparvata lugens幼虫和胡蜂Nasonia giraulti幼虫。TpAGO2基因靶向EST来源包括拟果蝇雌成虫，埃及伊蚊雌成虫，丽蝇蛹集金小蜂蛹和成虫，胡峰蛹和成虫、埃及伊蚊幼虫，褐飞虱幼虫和玉带凤蝶Papilio polytes蛹。TpAGO3基因靶向EST来源包括丽蝇蛹集金小蜂雌、雄蛹，埃及伊蚊雌成虫，茶足柄瘤蚜茧蜂Lysiphlebus testaceipes成虫。TpAGO4基因靶向EST来源包括丽蝇蛹集金小蜂雄蛹，丽蝇蛹集金小蜂雌成虫，赤拟谷盗Tribolium castaneum雌性卵，埃及伊蚊雌成蟲。TpAGO5基因靶向EST来源包括雄丽蝇蛹集金小蜂雄性蛹和成虫，豌豆长管蚜Acyrthosiphon pisum雄性若虫，桃蚜Myzus persicae雌成虫，黑腹果蝇和螺旋蝇Cochliomyia hominivorax卵，二斑叶螨Tetranychus urticae卵，食粪金龟Onthophagus taurus蛹，刺舌蝇Glossina morsitans成虫。TpAGO6基因靶向EST来源包括丽蝇蛹集金小蜂雄性蛹和成虫，家蚕雌性蛹，桃蚜雌成虫，果蝇卵，豌豆长管蚜若虫，食粪金龟蛹，玉带凤蝶成虫、三角涡虫Dugesia japonica、赤拟谷盗、刺舌蝇和冈比亚按蚊Anopheles gambiae成虫。
3结论与讨论
昆虫中小分子RNA可分为3种，siRNA（small interfering RNA）、miRNA（microRNA）及piRNA（PIWIinteracting RNA）。在siRNA通路中，RNA诱导沉默复合体（RNAinduced silencing complex，RISC）中的AGO2与siRNA双链体（siRNA duplex）的引导链（guide strand）结合，同时切割siRNA双链体的另一条过客链（passenger stand）使其脱离复合体；然后AGO2蛋白通过siRNA引导链连接序列互补的靶mRNA，促成靶基因的沉默。在miRNA通路中，AGO1蛋白与miRNA（引导链）/miRNA*（过客链）结合，分离miRNA* [10]；然后，与靶基因互补的miRNA能够促使AGO1对靶标mRNA切割[11]。在piRNA通路中，PIWI亚家族成员参与调控 [1213]，piRNA中多为逆转录转座子和转座子的反义链，PIWI和Aub蛋白与它们结合，引导并切割正义的逆转录转座子转录产生本来的正义piRNA [14]，AGO3结合正义piRNA，并切割来源于不同逆转录转座子分化的反义转录本[15]。
Argonaute 蛋白家族是一个高度保守的家族，该蛋白以基因家族的形式存在于绝大部分真核生物中。果蝇含有5 个特征性的Argonaute 蛋白：DmPiwi、DmAubergine、DmAgol、DmAgo2 和DmAgo3，其中DmPIWI、DmAubergine 和DmAgo3 都属于PIWI 亚家族[16]。而DmPIWI和DmAub蛋白的突变会影响果蝇胚胎发育。PIWI亚家族蛋白在果蝇中影响转基因调节的共抑制作用[17]，参与生殖干细胞的发育调节[18]。DmAub蛋白可以通过调节oskar和gurken的翻译及极细胞的形成来影响胚胎发育，DmAub蛋白也可以通过睾丸中的stellate调节抑制来体现它的必要性[19]。DmAGO1和DmAGO2基因表达贯穿果蝇整个胚胎发育时期，其中DmAGO1对于胚胎的发育系统有正调节作用。而且，DmAGO1与DmAGO2也可以在生殖系统外表达，具有更多的功能。另外，家蚕中的Argonaute 家族已经被鉴定出来，包括BmAgo1、BmAgo2、BmAgo3 和BmPIWI，且在数量和序列上都与其他昆虫是保守的[7]。前两者属于Argonaute 亚家族，分别在siRNA/miRNA 通路中发挥作用[2021]，后两者属于PIWI亚家族，在家蚕的生殖器官中表达量较高[20]。上述研究表明，Argonaute蛋白极有可能参与赤眼蜂生长发育和性别调控，也有可能参与Wolbachia感染对宿主赤眼蜂产雌孤雌生殖的分子调控。 本研究首次在短管赤眼蜂全基因組水平分离Argonaute蛋白，鉴定的6个TpAGO蛋白基因都含有典型的PAZ和PIWI结构域，与果蝇和家蚕的Argonaute蛋白基因结构基本一致。短管赤眼蜂TpAGO1和TpAGO2与NvAUB，DmPIWI和DmAUB，BmPIWI亲缘关系较近，推测赤眼蜂TpAGO12可能与果蝇和家蚕AGO蛋白功能相近，参与短管赤眼蜂生殖干细胞的形成，以及在赤眼蜂piRNA通路中起重要作用。TpAGO3与NvAGO3、DmAGO3和BmAGO3亲缘关系较近，推测赤眼蜂TpAGO3可能与家蚕AGO3蛋白功能相近，在幼虫期到成虫期的表达量明显不同，可能参与了幼虫组织的降解或蛹/成虫组织的生成等发育调节活动。短管赤眼蜂TpAGO5和TpAGO6与DmAGO1和BmAGO1亲缘关系较近，推测赤眼蜂TpAGO56可能与果蝇和家蚕AGO1蛋白功能相近，参与胚胎发育的调节。TpAGO4与NvAGO2，DmAGO2和BmAGO2亲缘关系较近，推测与果蝇DmAGO2功能相似，参与胚胎发育调节。本研究基于EST数据库揭示的短管赤眼蜂TpAGO基因表达结果发现， 供试6个TpAGO基因可能参与赤眼蜂性别调控，其中，TpAGO46不仅在赤眼蜂卵期高表达，与亲缘聚类结果相近，而且在蛹期和成虫期也具有较高表达；TpAGO13多在蛹期和成虫期有较高表达，在卵期没有表达。上述结果表明赤眼蜂6个TpAGO有可能都参与分裂期性别调控，但是不同亚家族在生长发育阶段具有明确的分工。
另外，TpAGO蛋白基因结构表现明显的多样性，基因外显子数量差异明显，从1到20个数量不等，可能与该家族基因Ka/Ks值偏高，最低的为0.732 1，存在较高的进化选择压力有关。其中，TpAGO2和TpAGO5，TpAGO3和TpAGO4两对基因间Ka/Ks值大于1，进化动力为正选择作用，其他组合间表现为纯化选择。值得一提的是，TpAGO4与其他的TpAGO蛋白基因相差较大，如编码蛋白长度最长、分子量、外显子数最多，在系统进化树上与果蝇AGO2同源，可能参与siRNA通路对胚胎发育的调控。
参考文献
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关键词 短管赤眼蜂；Argonaute；基因家族；生物信息学
中图分类号： S 476.3
文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.06.006
Identification and expression analysis of Argonaute protein gene
family in Trichogramma pretiosum
Yang Zhiqiang，Wang Liyan，Liang Hongyu，Liu Xu，Bai Xueping，Zhao Changjiang，Zhang Haiyan
（College of Agronomy，Key Laboratory of Crop Germplasm Improvement and Cultivation in Cold Regions of Heilongjiang
Provincial HigherEducation Institutions，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing163319， China）
Abstract
The Argonaute family play an important role in gene silencing of RNA induction in plants and animals. Six Argonaute proteins were identified and named in genomewide level in Trichogramma pretiosum by using the bioinformatics methods. Analysis results of protein structure and phylogenetic analysis showed that TpAGO family proteins were divided into two subgroups， PIWI and Ago， and the numbers of secondary structures of TpAGO protein were similar， while the distribution was different among TpAGOs， especially the helix structure was differently distributed. The gene structure of TpAGOs showed obvious diversity， and the exon numbers varied significantly， ranging from 1 to 20. The evolutionary powers of two pairs of genes were positive selection， including TpAGO2 and TpAGO5， TpAGO3 and TpAGO4， and other combinations were driven by purification options. Expressional profiles by ESTs showed that TpAGO was expressed in different developmental stages， including egg， larval， pupal and adult stages， and worked in single gender （female or male） in the same species， which suggested that TpAGOs were involved in sex and development regulation of T.pretiosum. This research helps to reveal the genetic mechanism of thelytoky pattern and promote the biocontrol application of Trichogramma.
Key words
Trichogramma pretiosum；Argonaute；gene family；bioinformatics analysis
害蟲生物防治是有害生物治理中最成功、最节约和环境安全的方法。理论研究的核心是明确各类天敌的特性及其对害虫的控制功能，以及天敌和害虫之间相互作用规律[1]。赤眼蜂属膜翅目，是一种卵寄生性天敌昆虫，目前已成为害虫生物防治中应用最多，范围最广的害虫天敌之一。其中，感染共生菌Wolbachia的赤眼蜂具有更好的应用前景，因其营产雌孤雌生殖方式致使赤眼蜂后代完全为雌性，同比大大提高了天敌赤眼蜂的寄生能力，即有效增强了天敌对害虫的控制能力，提高了生物防治效果。尽管已有大量研究表明，赤眼蜂的产雌孤雌生殖方式是由Wolbachia感染所决定的[24]，但是Wolbachia与赤眼蜂互作调控产雌孤雌生殖的分子机理至今未见明确报道。 MicroRNAs（miRNA）是内源非编码小RNA，在细胞生物学过程中发挥重要的调控作用，涉及发育、分化、凋亡和免疫等过程，值得一提的是，miRNA也参与Wolbachia与宿主互作调控[5]。那么，小RNA沉默复合体（RNAinduced silencing complex，RISC）的重要组成部分Argonaute蛋白（Argonaute protein）在Wolbachia与宿主互作中的功能如何？Argonaute 蛋白是一个高度保守的家族，含有PIWI和PAZ两个共同的结构域，存在于绝大部分真核生物中。Argonaute蛋白在各个物种间的数量差距很大，其中人类Homo sapiens含有8种[6]，拟南芥Arabidopsis thaliana中有10种[7]、果蝇 Drosophila melanogaster中有 5种、家蚕Bombyx mori 4种[8]，秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans 27种[9]。但是，迄今为止，关于赤眼蜂Argonaute蛋白及其功能研究尚未见报道。
本研究利用生物信息学方法，在短管赤眼蜂Trichogramma pretiosum基因组水平分离鉴定Argonaute蛋白基因，在对基因结构、蛋白结构和系统进化分析的同时，进行了基于EST的表达谱分析，探讨Argonaute蛋白基因的功能。该研究有助于揭示Argonaute蛋白及其协调小RNA途径在赤眼蜂生长发育和性别调控中的作用，为在表观遗传学水平解析赤眼蜂产雌孤雌生殖机理奠定理论基础。
1材料与方法
1.1基因家族成员鉴定
利用已发表的家蚕、果蝇Argonaute蛋白序列为种子序列，通过BLASTp在NCBI数据库（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索短管赤眼蜂基因组（JARR00000000.1）；同时，以蛋白保守结构域PIWI和PAZ为种子在NCBI数据库搜索短管赤眼蜂基因组，分离鉴定短管赤眼蜂Argonaute蛋白。然后，使用BioEdit软件构建本地数据库，对上述两种方法获得的短管赤眼蜂Argonaute蛋白进行筛选去冗余并命名TpAGO。采用Expasy（http：∥web.expasy.org/protparam/）分析蛋白分子式、分子量和等电点等数据；采用WoLF PSORT（http：∥www.genscript.com/tools/wolfpsort）对蛋白进行亚细胞定位预测。
1.2氨基酸比对及系统进化树的构建
使用DNAMAN对短管赤眼蜂TpAGO蛋白进行比对作图；使用MEGA7.0对不同昆虫AGO蛋白采用邻接法比对并生成系统进化树，进行1 000次Bootstrap检验。
1.3蛋白高级结构分析
利用SOPMA 在线分析软件（https：∥npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分析蛋白二级结构；使用Expasy（https：∥swissmodel.expasy.org/interactive）分析蛋白三級结构。
1.4基因结构分析
短管赤眼蜂TpAGO全长基因提交GSDS软件（http：∥gsds.cbi.pku.edu.cn/）绘制基因结构图。
1.5碱基替换率分析
将短管赤眼蜂的TpAGO基因的编码区（去终止子）通过MEGA7.0的ClustalW比对，然后使用DNAsp软件计算TpAGO基因的非同义替换率Ka、同义替换率Ks以及他们的比值（Ka/Ks）。
1.6基因表达分析
使用短管赤眼蜂TpAGO基因编码序列在NCBI的EST数据库进行BLASTn分析；同时使用TpAGO氨基酸序列在NCBI的EST数据库进行tBLASTn分析，获得TpAGO基因的EST表达数据。
2结果与分析
2.1短管赤眼蜂TpAGO蛋白基因的鉴定
通过两种方法共获得191条序列，一方面采用DNAMAN进行序列分析，去除冗余序列，另一方面利用NCBI数据库对候选蛋白进行结构域分析，最终获得6个非冗余的短管赤眼蜂AGO蛋白，分别命名为TpAGO1至TpAGO6（表1）。TpAGO蛋白编码基因长度介于2 364 bp（TpAGO2.1）至3 144 bp（TpAGO4）之间。其中，4个TpAGO蛋白预测为细胞质或细胞核定位，包括TpAGO1、TpAGO2、TpAGO3和TpAGO4；2个TpAGO蛋白预测为线粒体或细胞核定位，分别为TpAGO5和TpAGO6。
2.2短管赤眼蜂AGO蛋白结构与系统进化分析
使用DNAMAN对鉴定获得的6种TpAGO蛋白进行结构域分析，均具有ArgoN、PAZ和PIWI保守结构域，氨基酸组成变异较大（图1）。通过邻接法对鉴定的6个短管赤眼蜂、4个家蚕、5个黑腹果蝇、3个丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis的Argonaute蛋白氨基酸序列进行比对构建系统进化树（图2）。通过系统进化分析发现，供试的18个Argonaute蛋白可分为两大亚家族，分别为Ago亚家族和PIWI亚家族。PIWI亚家族蛋白涵盖4个物种的10个成员，含有典型的PAZ、PIWI和ArgoN结构域，包括短管赤眼蜂TpAGO1、TpAGO2和TpAGO3，果蝇DmPIWI、DmAUB和DmAGO3，家蚕BmPIWI、BmAGO3，丽蝇蛹集金小蜂NvAUB和NvAGO3。其中，短管赤眼蜂TpAGO1和TpAGO2与NvAUB、DmPIWI和DmAUB、BmPIWI亲缘关系较近，TpAGO3与NvAGO3、DmAGO3和BmAGO3亲缘关系较近。Ago亚家族蛋白涵盖4个物种的8个成员，含有典型的PAZ、PIWI、ArgoN和Argol1结构域（图1），包括短管赤眼蜂TpAGO4、TpAGO5和TpAGO6，果蝇DmAGO1和DmAGO2，家蚕BmAGO1和BmAGO2，丽蝇蛹集金小蜂。其中，短管赤眼蜂TpAGO5和TpAGO6与DmAGO1和BmAGO1亲缘关系较近；TpAGO4与NvAGO2、DmAGO2和BmAGO2亲缘关系较近。 2.3短管赤眼蜂TpAGO基因结构与进化动力分析
对6个短管赤眼蜂TpAGO基因结构进行分析（图3）发现，AGO蛋白基因结构表现明显的多样性，基因外显子数量差异明显，从1到20个数量不等，与蛋白氨基酸结构和亚家族分类无明显对应关系。其中，TpAGO1含有10个外显子，TpAGO2有8个外显子，TpAGO3含有11个外显子，TpAGO4含有20个外显子， TpAGO6只有1个外显子。值得注意的是TpAGO5含有12个外显子，且内含子跨度较大，最大内含子跨度为32 623 bp，而且内含子中间有许多未知序列，该基因结构或基因组序列需进一步确证。此外6个TpAGO基因终止密码子也不完全相同，除TpAGO6终止密码子为tag外，其余5个TpAGO基因的终止子均为taa。
另外，通过对短管赤眼蜂TpAGO基因编码区序列碱基替代率分析（表2）发现，Ka/Ks比值高于1的组合有TpAGO2和TpAGO5，TpAGO3和TpAGO4，表明这两对基因间（或者两对基因所在两个亚家族间）进化动力为正选择作用。其他组合的Ka/Ks比值均小于1，表现为纯化选择。但是AGO基因家族成员间Ka/Ks比值整体较高，最低的为0.732 1，表明该家族基因可能经受较大的选择压力，可能与基因结构的多样性有一定关联。
2.4短管赤眼蜂TpAGO蛋白高级结构分析
通过软件对6个TpAGO蛋白的二级和三级结构进行分析（表3，图4，5），4种二级结构α螺旋、延伸链、β折叠和无规则卷曲在AGO蛋白间数量比例差异不大，分布却存在一定差异（图4），但是AGO蛋白的三级结构基本相似（图5），相差不大。供试的6个AGO蛋白中α螺旋氨基酸数量比例在28.37%～40.64%之间；延伸链的氨基酸数量比例在17.86%～25.16%之间；β折叠的氨基酸数量比例在7.59%～10.29%之间；无规则卷曲的氨基酸数量比例在30.07%～44.70%之间。而且，均以α螺旋和无规则卷曲两种二级结构为主。其中，α螺旋分布在AGO蛋白间存在一定差异（图4），PIWI亚家族蛋白（TpAGO1、TpAGO2和TpAGO3）的N端α螺旋分布明显高于Ago亚家族蛋白（TpAGO4、TpAGO5和TpAGO6）。上述结构分析结果与蛋白进化存在明显的相关性，表明两个亚家族成员在功能进化上存在一定分歧。
2.5短管赤眼蜂TpAGO基因在发育阶段的表达
通过TpAGO基因在NCBI的EST数据库比对分析，EST靶向序列以BLASTn比对中E值小于2e13或tBLASTn比对中E值小于1e67为标准，获得短管赤眼蜂TpAGO基因表达信息（表4），结果表明TpAGO基因在昆虫的卵期、幼虫期、蛹期和成虫期均有不同程度的表达，而且靶向EST在同一物种中具有单一性别（雌性或雄性）表达特性。其中TpAGO1基因靶向EST来源包括丽蝇蛹集金小蜂雄性蛹，埃及伊蚊Aedes aegypti雌成虫，拟果蝇雌成虫，褐飞虱Nilaparvata lugens幼虫和胡蜂Nasonia giraulti幼虫。TpAGO2基因靶向EST来源包括拟果蝇雌成虫，埃及伊蚊雌成虫，丽蝇蛹集金小蜂蛹和成虫，胡峰蛹和成虫、埃及伊蚊幼虫，褐飞虱幼虫和玉带凤蝶Papilio polytes蛹。TpAGO3基因靶向EST来源包括丽蝇蛹集金小蜂雌、雄蛹，埃及伊蚊雌成虫，茶足柄瘤蚜茧蜂Lysiphlebus testaceipes成虫。TpAGO4基因靶向EST来源包括丽蝇蛹集金小蜂雄蛹，丽蝇蛹集金小蜂雌成虫，赤拟谷盗Tribolium castaneum雌性卵，埃及伊蚊雌成蟲。TpAGO5基因靶向EST来源包括雄丽蝇蛹集金小蜂雄性蛹和成虫，豌豆长管蚜Acyrthosiphon pisum雄性若虫，桃蚜Myzus persicae雌成虫，黑腹果蝇和螺旋蝇Cochliomyia hominivorax卵，二斑叶螨Tetranychus urticae卵，食粪金龟Onthophagus taurus蛹，刺舌蝇Glossina morsitans成虫。TpAGO6基因靶向EST来源包括丽蝇蛹集金小蜂雄性蛹和成虫，家蚕雌性蛹，桃蚜雌成虫，果蝇卵，豌豆长管蚜若虫，食粪金龟蛹，玉带凤蝶成虫、三角涡虫Dugesia japonica、赤拟谷盗、刺舌蝇和冈比亚按蚊Anopheles gambiae成虫。
3结论与讨论
昆虫中小分子RNA可分为3种，siRNA（small interfering RNA）、miRNA（microRNA）及piRNA（PIWIinteracting RNA）。在siRNA通路中，RNA诱导沉默复合体（RNAinduced silencing complex，RISC）中的AGO2与siRNA双链体（siRNA duplex）的引导链（guide strand）结合，同时切割siRNA双链体的另一条过客链（passenger stand）使其脱离复合体；然后AGO2蛋白通过siRNA引导链连接序列互补的靶mRNA，促成靶基因的沉默。在miRNA通路中，AGO1蛋白与miRNA（引导链）/miRNA*（过客链）结合，分离miRNA* [10]；然后，与靶基因互补的miRNA能够促使AGO1对靶标mRNA切割[11]。在piRNA通路中，PIWI亚家族成员参与调控 [1213]，piRNA中多为逆转录转座子和转座子的反义链，PIWI和Aub蛋白与它们结合，引导并切割正义的逆转录转座子转录产生本来的正义piRNA [14]，AGO3结合正义piRNA，并切割来源于不同逆转录转座子分化的反义转录本[15]。
Argonaute 蛋白家族是一个高度保守的家族，该蛋白以基因家族的形式存在于绝大部分真核生物中。果蝇含有5 个特征性的Argonaute 蛋白：DmPiwi、DmAubergine、DmAgol、DmAgo2 和DmAgo3，其中DmPIWI、DmAubergine 和DmAgo3 都属于PIWI 亚家族[16]。而DmPIWI和DmAub蛋白的突变会影响果蝇胚胎发育。PIWI亚家族蛋白在果蝇中影响转基因调节的共抑制作用[17]，参与生殖干细胞的发育调节[18]。DmAub蛋白可以通过调节oskar和gurken的翻译及极细胞的形成来影响胚胎发育，DmAub蛋白也可以通过睾丸中的stellate调节抑制来体现它的必要性[19]。DmAGO1和DmAGO2基因表达贯穿果蝇整个胚胎发育时期，其中DmAGO1对于胚胎的发育系统有正调节作用。而且，DmAGO1与DmAGO2也可以在生殖系统外表达，具有更多的功能。另外，家蚕中的Argonaute 家族已经被鉴定出来，包括BmAgo1、BmAgo2、BmAgo3 和BmPIWI，且在数量和序列上都与其他昆虫是保守的[7]。前两者属于Argonaute 亚家族，分别在siRNA/miRNA 通路中发挥作用[2021]，后两者属于PIWI亚家族，在家蚕的生殖器官中表达量较高[20]。上述研究表明，Argonaute蛋白极有可能参与赤眼蜂生长发育和性别调控，也有可能参与Wolbachia感染对宿主赤眼蜂产雌孤雌生殖的分子调控。 本研究首次在短管赤眼蜂全基因組水平分离Argonaute蛋白，鉴定的6个TpAGO蛋白基因都含有典型的PAZ和PIWI结构域，与果蝇和家蚕的Argonaute蛋白基因结构基本一致。短管赤眼蜂TpAGO1和TpAGO2与NvAUB，DmPIWI和DmAUB，BmPIWI亲缘关系较近，推测赤眼蜂TpAGO12可能与果蝇和家蚕AGO蛋白功能相近，参与短管赤眼蜂生殖干细胞的形成，以及在赤眼蜂piRNA通路中起重要作用。TpAGO3与NvAGO3、DmAGO3和BmAGO3亲缘关系较近，推测赤眼蜂TpAGO3可能与家蚕AGO3蛋白功能相近，在幼虫期到成虫期的表达量明显不同，可能参与了幼虫组织的降解或蛹/成虫组织的生成等发育调节活动。短管赤眼蜂TpAGO5和TpAGO6与DmAGO1和BmAGO1亲缘关系较近，推测赤眼蜂TpAGO56可能与果蝇和家蚕AGO1蛋白功能相近，参与胚胎发育的调节。TpAGO4与NvAGO2，DmAGO2和BmAGO2亲缘关系较近，推测与果蝇DmAGO2功能相似，参与胚胎发育调节。本研究基于EST数据库揭示的短管赤眼蜂TpAGO基因表达结果发现， 供试6个TpAGO基因可能参与赤眼蜂性别调控，其中，TpAGO46不仅在赤眼蜂卵期高表达，与亲缘聚类结果相近，而且在蛹期和成虫期也具有较高表达；TpAGO13多在蛹期和成虫期有较高表达，在卵期没有表达。上述结果表明赤眼蜂6个TpAGO有可能都参与分裂期性别调控，但是不同亚家族在生长发育阶段具有明确的分工。
另外，TpAGO蛋白基因结构表现明显的多样性，基因外显子数量差异明显，从1到20个数量不等，可能与该家族基因Ka/Ks值偏高，最低的为0.732 1，存在较高的进化选择压力有关。其中，TpAGO2和TpAGO5，TpAGO3和TpAGO4两对基因间Ka/Ks值大于1，进化动力为正选择作用，其他组合间表现为纯化选择。值得一提的是，TpAGO4与其他的TpAGO蛋白基因相差较大，如编码蛋白长度最长、分子量、外显子数最多，在系统进化树上与果蝇AGO2同源，可能参与siRNA通路对胚胎发育的调控。
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