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【摘要】 目的：研究癫痫患者大脑皮质中微血管管径大小及分布规律。方法：取难治性癫痫患者手术切除的大脑皮质组织，应用胶质纤维酸性蛋白抗体标记的免疫组织化学方法进行染色，观察组织切片中大脑微血管形态，应用Image J图像处理分析软件对脑微血管管径大小、数量进行测量及分析。结果：测量的脑微血管按照直径大小分为以下五组：A：≤10μm；B：10-25μm；C：25-50μm；D：50-100μm；E：>100μm。一共测量了灰质中的304个脑微血管，直径分布于6.027-162.253μm之间，平均值=50.537μm，标准差(s)=30.307μm(n=304个血管，6个患者)。灰质中A、B、C、D、E各组血管数目分别为：18，54，103，114，15；比例分别为：5.921%，17.763%，33.882%，37.500%，4.934%。结论：我们首次应用图像处理分析软件Image J描述了癫痫患者大脑皮质组织切片中脑微血管管径大小、分布规律。
【关键词】 脑微血管；癫痫；Image J
前言
癫痫由不同病因所引起，目前对其致病机制并未完全明确。有研究显示脑血流量与癫痫密切相关，而脑血流量主要是通过脑血管的收缩和/或舒张来调控[1]。我们首次应用图像处理分析软件Image J对癫痫患者大脑皮质组织切片中微血管管径大小、数量、比例等各项指标进行了测量和分析，初步描述癫痫患者大脑皮质微血管特点，为进一步研究打下一定的基础，提供一定的线索。我们主要尝试从神经病理改变，尤其是大脑皮质微血管的改变方面来了解癫痫的可能病因。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 脑组织来源 难治性癫痫患者6例，来自广东省第二人民医院。目前上市药物无法控制其癫痫发作，行脑叶切除手术治疗。患者术前已行脑电图监测及颅脑MRI检查，手术切除部分为术前计划切除的部分，无用于单独研究的正常组织部分。
1.1.2 主要药品与试剂 鼠抗人胶质纤维酸性蛋白IgG、生物素化羊抗鼠IgG：美国Boehringer Mannheim公司；
1.1.3 主要器械和仪器 Olympus照相显微镜：美国Sigma公司；低温保持器：德国Heidelberg公司；冰冻切片机：德国Leicacm公司；Image J图像处理分析软件：美国国立卫生研究院(NIH)免费下载软件，下载地址：http://rsb.info.nih.gov/ij/download/win32/ij133-setup.exe。
1.2 免疫组化
1.2.1 切片制作及免疫组化染色 新鲜的标本代表性部分由临床病理师在手术室切成0.5-0.7cm厚的组织块，制作成为切片。利用鼠抗人胶质纤维酸性蛋白IgG、生物素化羊抗鼠IgG进行免疫组化染色。
1.2.2 免疫组化判断标准及方法 脑微血管管壁被染成棕色。
1.3 图像分析及统计方法
1.3.1 图像分析方法 脑组织切片应用免疫组化方法染色后，采用Olympus照相显微镜，设置多组物镜(2.5倍、5倍、10倍、20倍、40倍)，对染色切片进行多方位摄片，图片保存为.tiff格式存档。采用Image J图像处理分析软件，对6个病人多组图像(主要为2.5倍物镜下图像)的脑血管进行测量分析。对脑皮质组织切片中血管直径、数量、比例等各项指标进行测量和分析。直径的数据采用SPSS 10.0进行处理，采用均数±标准差(s)的表示方式。
1.3.2 血管直径测量及分组依据 研究血管时多以直径表示其大小[2-4]。微血管直径介于10-200μm之间，毛细血管直径6-10μm[7]。Mary A. Bell和M. J. Ball认为脑毛细血管直径≤8μm，但为了直观方便地进行测量和分析，他们将直径≤10μm的血管归为毛细血管[2]。因此本文中，毛细血管指的是直径≤10μm且被染色的血管。参照既往研究[3]，将测量的脑微血管按照直径大小分为以下五组：A：≤10μm；B：10-25μm；C：25-50μm；D：50-100μm；E：>100μm。多数学者最关注直径在30-50μm的脑血管[3]。在本课题的图片中，可以看到依据切面(图片平面)与血管走行方向(血管纵轴)所成的角度脑血管大致分为两大类，一类是切面与血管纵轴所成角度≤90°，称为横切血管；另一类是切面刚好平行于血管纵轴，称为纵切血管。测量脑血管直径的方法如下：对于横切血管，在血管内腔中，选取最长的一个线段作为长径，与该线段垂直的所有其他线段中，选择最长的一个作为短径。在纵切血管中，则选取管腔内壁间最长与最短的两个线段分别作为长、短径。分别记录长、短径，并计算此两个数值的算术平均值作为血管直径[4]。
2 结果
脑微血管按照直径大小分为以下五组：A：≤10μm；B：10-25μm；C：25-50μm；D：50-100μm；E：>100μm。
2.1 在随机抽取的标本图片中，我们一共测量了灰质中的304个脑微血管，我们测量的脑血管的直径分布于6.027-162.253μm之间，平均值=50.537μm，标准差(s)=30.307μm(n=304个血管，6个患者)。各组中脑微血管数目及管径分布见表1。
表1 各组中脑微血管数目及管径(μm)分布
2.2 灰质中A、B、C、D、E各组血管数目分别为：18，54，103，114，15；比例分别为：5.921%，17.763%，33.882%，37.500%，4.934%；如图1。
3 讨论
脑血管发育与癫痫
3.1 脑血管发育的重要性 胚胎及胎儿期是机体发育过程中最为重要的环节，而神经系统发育，尤其在胚胎时期的发育至关重要。脑血管发育对于神经系统格外重要。脑血管是脑组织养分供应、物质代谢的通道，与其发育异常相关的多种疾病，很大程度上与其发病机制未完全阐明有关，出生后脑血管的成熟对于诱导脑血管内皮细胞的屏障作用是必需的[5]。李明昌等利用基因芯片技术，将处于发育早期的胎儿脑动脉与正常成人脑动脉的基因表达谱进行了比较，得出人胎脑动脉的正常发育受到众多基因调控的结论[6]。 3.2 脑血流改变与癫痫 Michael M. Haglund和Daryl W. Hochman利用血红蛋白可以吸收可见光及红外线光谱的特点，用连接有电脑摄像的光学显微镜描绘了灵长类动物脑皮质癫痫活动相关的血液动力学改变。局部神经活动的增加会改变周围脑组织的血液供应及氧容量。在新皮质中，这些血液动力学改变主要是通过神经活动部位附近软膜下的微动脉扩张来介导的[1]。
我们推测部分癫痫患者发病原因与脑血管异常有关，包括脑血流、血-脑屏障的异常改变有关，这些异常从何而来，可能是脑微血管，包括毛细血管的发育过程中出现了紊乱。我们希望通过描述癫痫患者大脑皮质组织切片中微血管的管径大小及各种类型血管的比例，为进一步阐明癫痫患者脑组织中微血管的形态学改变提供线索。目前尚缺乏正常胚胎或癫痫患儿大脑皮质微血管的相关类似描述，我们期待借助于新方法、新技术进一步阐明人类胚胎脑血管的形态学特点。
4 结论
我们首次应用图像处理分析软件Image J描述了癫痫患者大脑皮质组织切片中微血管管径大小、分布规律。
参考文献
[1] Michael M. Haglund and Daryl W. Hochman. Imaging of Intrinsic Optical Signals in Primate Cortex during Epileptiform Activity. Epilepsia, 2007, 48 (Suppl. 4): 65–74
[2] Mary A. Bell and M. J. Ball. Morphometric comparison of hippocampal micro- vasculature in ageing and demented people: Diameters and densities. Acta Nueropathologica, 1981 Dec, 53(4): 299-318
[3] E Christiaan Boerma, Keshen R Mathura, Peter HJ van der Voort, etc. Quantifying bedside-derived imaging of microcirculatory abnormalities in septic patients: a prospective validation study. Critical Care, 2005 Sep, 9(6): 601-606
[4] Frederik A. Pennings, Gerrit J. Bouma, and Can Ince. Direct Observation of the Human Cerebral Microcirculation During Aneurysm Surgery Reveals Increased Arteriolar Contractility. Stroke, 2004 Jun, 35: 1284-1288
[5] 蒋莉，郭艺.小儿脑血管病的诊断与治疗。中国实用儿科学杂志，2005，20（3）：129-131
[6] 李明昌，石忠松，夏之柏，等.人胎脑动脉发育相关基因表达谱的研究.中国病理生理杂志，2006，22(12)：2311-2316
作者简介：
林宋斌，广东省第二人民医院神经内科，医师
袁明贤，广东省第二人民医院神经内科，医师
陈俊抛，广东省第二人民医院神经内科，主任医师
【关键词】 脑微血管；癫痫；Image J
前言
癫痫由不同病因所引起，目前对其致病机制并未完全明确。有研究显示脑血流量与癫痫密切相关，而脑血流量主要是通过脑血管的收缩和/或舒张来调控[1]。我们首次应用图像处理分析软件Image J对癫痫患者大脑皮质组织切片中微血管管径大小、数量、比例等各项指标进行了测量和分析，初步描述癫痫患者大脑皮质微血管特点，为进一步研究打下一定的基础，提供一定的线索。我们主要尝试从神经病理改变，尤其是大脑皮质微血管的改变方面来了解癫痫的可能病因。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 脑组织来源 难治性癫痫患者6例，来自广东省第二人民医院。目前上市药物无法控制其癫痫发作，行脑叶切除手术治疗。患者术前已行脑电图监测及颅脑MRI检查，手术切除部分为术前计划切除的部分，无用于单独研究的正常组织部分。
1.1.2 主要药品与试剂 鼠抗人胶质纤维酸性蛋白IgG、生物素化羊抗鼠IgG：美国Boehringer Mannheim公司；
1.1.3 主要器械和仪器 Olympus照相显微镜：美国Sigma公司；低温保持器：德国Heidelberg公司；冰冻切片机：德国Leicacm公司；Image J图像处理分析软件：美国国立卫生研究院(NIH)免费下载软件，下载地址：http://rsb.info.nih.gov/ij/download/win32/ij133-setup.exe。
1.2 免疫组化
1.2.1 切片制作及免疫组化染色 新鲜的标本代表性部分由临床病理师在手术室切成0.5-0.7cm厚的组织块，制作成为切片。利用鼠抗人胶质纤维酸性蛋白IgG、生物素化羊抗鼠IgG进行免疫组化染色。
1.2.2 免疫组化判断标准及方法 脑微血管管壁被染成棕色。
1.3 图像分析及统计方法
1.3.1 图像分析方法 脑组织切片应用免疫组化方法染色后，采用Olympus照相显微镜，设置多组物镜(2.5倍、5倍、10倍、20倍、40倍)，对染色切片进行多方位摄片，图片保存为.tiff格式存档。采用Image J图像处理分析软件，对6个病人多组图像(主要为2.5倍物镜下图像)的脑血管进行测量分析。对脑皮质组织切片中血管直径、数量、比例等各项指标进行测量和分析。直径的数据采用SPSS 10.0进行处理，采用均数±标准差(s)的表示方式。
1.3.2 血管直径测量及分组依据 研究血管时多以直径表示其大小[2-4]。微血管直径介于10-200μm之间，毛细血管直径6-10μm[7]。Mary A. Bell和M. J. Ball认为脑毛细血管直径≤8μm，但为了直观方便地进行测量和分析，他们将直径≤10μm的血管归为毛细血管[2]。因此本文中，毛细血管指的是直径≤10μm且被染色的血管。参照既往研究[3]，将测量的脑微血管按照直径大小分为以下五组：A：≤10μm；B：10-25μm；C：25-50μm；D：50-100μm；E：>100μm。多数学者最关注直径在30-50μm的脑血管[3]。在本课题的图片中，可以看到依据切面(图片平面)与血管走行方向(血管纵轴)所成的角度脑血管大致分为两大类，一类是切面与血管纵轴所成角度≤90°，称为横切血管；另一类是切面刚好平行于血管纵轴，称为纵切血管。测量脑血管直径的方法如下：对于横切血管，在血管内腔中，选取最长的一个线段作为长径，与该线段垂直的所有其他线段中，选择最长的一个作为短径。在纵切血管中，则选取管腔内壁间最长与最短的两个线段分别作为长、短径。分别记录长、短径，并计算此两个数值的算术平均值作为血管直径[4]。
2 结果
脑微血管按照直径大小分为以下五组：A：≤10μm；B：10-25μm；C：25-50μm；D：50-100μm；E：>100μm。
2.1 在随机抽取的标本图片中，我们一共测量了灰质中的304个脑微血管，我们测量的脑血管的直径分布于6.027-162.253μm之间，平均值=50.537μm，标准差(s)=30.307μm(n=304个血管，6个患者)。各组中脑微血管数目及管径分布见表1。
表1 各组中脑微血管数目及管径(μm)分布
2.2 灰质中A、B、C、D、E各组血管数目分别为：18，54，103，114，15；比例分别为：5.921%，17.763%，33.882%，37.500%，4.934%；如图1。
3 讨论
脑血管发育与癫痫
3.1 脑血管发育的重要性 胚胎及胎儿期是机体发育过程中最为重要的环节，而神经系统发育，尤其在胚胎时期的发育至关重要。脑血管发育对于神经系统格外重要。脑血管是脑组织养分供应、物质代谢的通道，与其发育异常相关的多种疾病，很大程度上与其发病机制未完全阐明有关，出生后脑血管的成熟对于诱导脑血管内皮细胞的屏障作用是必需的[5]。李明昌等利用基因芯片技术，将处于发育早期的胎儿脑动脉与正常成人脑动脉的基因表达谱进行了比较，得出人胎脑动脉的正常发育受到众多基因调控的结论[6]。 3.2 脑血流改变与癫痫 Michael M. Haglund和Daryl W. Hochman利用血红蛋白可以吸收可见光及红外线光谱的特点，用连接有电脑摄像的光学显微镜描绘了灵长类动物脑皮质癫痫活动相关的血液动力学改变。局部神经活动的增加会改变周围脑组织的血液供应及氧容量。在新皮质中，这些血液动力学改变主要是通过神经活动部位附近软膜下的微动脉扩张来介导的[1]。
我们推测部分癫痫患者发病原因与脑血管异常有关，包括脑血流、血-脑屏障的异常改变有关，这些异常从何而来，可能是脑微血管，包括毛细血管的发育过程中出现了紊乱。我们希望通过描述癫痫患者大脑皮质组织切片中微血管的管径大小及各种类型血管的比例，为进一步阐明癫痫患者脑组织中微血管的形态学改变提供线索。目前尚缺乏正常胚胎或癫痫患儿大脑皮质微血管的相关类似描述，我们期待借助于新方法、新技术进一步阐明人类胚胎脑血管的形态学特点。
4 结论
我们首次应用图像处理分析软件Image J描述了癫痫患者大脑皮质组织切片中微血管管径大小、分布规律。
参考文献
[1] Michael M. Haglund and Daryl W. Hochman. Imaging of Intrinsic Optical Signals in Primate Cortex during Epileptiform Activity. Epilepsia, 2007, 48 (Suppl. 4): 65–74
[2] Mary A. Bell and M. J. Ball. Morphometric comparison of hippocampal micro- vasculature in ageing and demented people: Diameters and densities. Acta Nueropathologica, 1981 Dec, 53(4): 299-318
[3] E Christiaan Boerma, Keshen R Mathura, Peter HJ van der Voort, etc. Quantifying bedside-derived imaging of microcirculatory abnormalities in septic patients: a prospective validation study. Critical Care, 2005 Sep, 9(6): 601-606
[4] Frederik A. Pennings, Gerrit J. Bouma, and Can Ince. Direct Observation of the Human Cerebral Microcirculation During Aneurysm Surgery Reveals Increased Arteriolar Contractility. Stroke, 2004 Jun, 35: 1284-1288
[5] 蒋莉，郭艺.小儿脑血管病的诊断与治疗。中国实用儿科学杂志，2005，20（3）：129-131
[6] 李明昌，石忠松，夏之柏，等.人胎脑动脉发育相关基因表达谱的研究.中国病理生理杂志，2006，22(12)：2311-2316
作者简介：
林宋斌，广东省第二人民医院神经内科，医师
袁明贤，广东省第二人民医院神经内科，医师
陈俊抛，广东省第二人民医院神经内科，主任医师