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摘要：目的：优化重组大肠杆菌表达β-甘露聚糖酶的条件；方法：利用单因素试验和正交试验，确定重组β-甘露聚糖酶表达的诱导温度、时间及pH；结果：最佳产酶条件为；诱导温度60℃，诱导时间7h，pH6.0。结论：表达优化条件稳定性好，可为后续的工业化生产奠定基础。
关键词：重组β-甘露聚糖酶；诱导条件优化；正交试验
项目基金：吉林农业科技学院校级微生物重点学科培育项目（编号：吉农院合字〔2013〕第X006 号）
中图分类号： G633.91 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.21.032
β-甘露聚糖酶（β-mannanase，EC.3.2.1.78），全称β-1，4-D-甘露聚糖酶，是作用于甘露聚糖β-1，4-D-甘露糖苷键的内切水解酶，它广泛存在于动物（如海洋软体动物的肠道分泌物）、植物（如豆类植物发芽的种子、魔芋萌发的球茎）和微生物（多种细菌、真菌和放线菌）中，其中微生物来源的β-甘露聚糖酶种类多、活性高、容易提取，是β-甘露聚糖酶的主要来源，也是该酶工业化生产的主要来源[1]。作为一种新型酶制剂，β-甘露聚糖酶广泛应用于食品、饲料、纺织、造纸、生物漂白、石油开采以及洗涤剂开发等领域，如在食品领域β-甘露聚糖酶可水解半乳糖甘露聚糖等多糖形成甘露寡糖，后者可用于改善人或动物肠道内的菌群环境，防止便秘或腹泻，在纺织领域，β-甘露聚糖酶可用于苎麻脱胶过程中半纤维素的降解，提高织物品质、减少能耗和环境污染等[2]。
目前，日本已经成功利用β-甘露聚糖酶生产瓜儿胶甘露寡糖，并研制出功能食品，美国chem gen公司也已生产出饲用酶制剂β-甘露聚糖酶[3]，而我国对β-甘露聚糖酶的研究还相对落后，在工业生产上缺少高质量的酶源，因此筛选和构建高产优质酶菌株、优化菌株产酶条件成为现阶段的研究热点。本试验首次以含有地衣芽孢杆菌ATCC14580 β-甘露聚糖酶基因的大肠杆菌BL21为试验材料，利用单因素试验和正交试验，优化重组大肠杆菌表达β-甘露聚糖酶的条件，为该酶的工业化生产奠定基础。
1材料与方法
1.1 试验材料
含有地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因的大肠杆菌BL21，由实验室制备。IPTG购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他试剂均为国产分析纯，培养基为常规LB培养基。
1.2 方法
1.2.1 工程菌的活化 将冻存的工程菌在含有卡那霉素的LB固体培养基中划线培养过夜，挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养过夜，37℃、180转/分钟。
1.2.2 单因素试验 将活化的工程菌接种于LB培养液中，加入0.5 mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达，利用单因素试验考察诱导时间、诱导温度以及pH对β-甘露聚糖酶酶活的影响，每组试验重复3次。
1.2.3 β-甘露聚糖酶酶活检测 参照《生化实验方法和技术》的方法，采用DNS法测定酶活，酶活性单位定义为：在实验反应条件下，1分钟水解得到1μmol还原糖所需要的酶量定义为1U，以酶活最高的为100%来计算相对酶活[4]。
1.2.4 正交试验优化 根据单因素试验结果，利用正交试验考察诱导时间、诱导温度和pH对工程菌重组酶活性的影响，每个因素选取3个水平，以相对酶活为考察指标，按照L9（33）正交表进行试验，考察因素表，见表1。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 诱导温度对β-甘露聚糖酶活性的影响 培养基中加入终浓度为0.5 mmolL IPTG诱导重组酶表达，分别设定诱导温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，诱导时间5小时，pH为6.0，诱导温度对β-甘露聚糖酶活性的影响如图1所示，可以看出，诱导温度在30℃～100℃范围内，β-甘露聚糖酶活性活性呈先升后降趋势，且温度为60℃时，β-甘露聚糖酶活性最高，为38.16 U/mL。
2.1.2 诱导时间对β-甘露聚糖酶活性的影响 为研究诱导时间对β-甘露聚糖酶活性的影响，设定诱导剂IPTG终浓度为0.5 mmolL，诱导温度60℃，pH为6.0，诱导时间分别设定为3、4、5、6、7、8、9、10小时，结果如图2所示，可以看出，诱导时间在3～10小时范围内，β-甘露聚糖酶活性活性呈先升后降趋势，且诱导时间为7h时，β-甘露聚糖酶活性活性最高，为39.93 U/mL。
2.1.3 pH对β-甘露聚糖酶活性的影响 为研究诱导pH对β-甘露聚糖酶活性的影响，设定诱导剂IPTG终浓度为0.5 mmolL，诱导温度60℃，诱导时间为7小时，pH分别设定为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，结果如图3所示，pH在4.0～9.0范围内，β-甘露聚糖酶活性活性呈先升后降趋势，且pH6.0时，β-甘露聚糖酶活性活性最高，为39.96 U/mL。
2.2 正交试验结果
R2 =0.984（调整R2=0.935）
正交试验及极差分析结果如表2所示，可以看出RC>RA>RB，即pH对β-甘露聚糖酶酶活性影响最大，诱导温度其次，诱导时间影响最小。表3为方差分析结果，可知pH和诱导温度对β-甘露聚糖酶酶活性影响显著，诱导时间影响不显著，影响程度与极差分析结果一致。综上，重组β-甘露聚糖酶最佳表达条件为A2B2C2，即诱导温度60℃，诱导时间7小时、pH 为6.0，在此条件下进行验证试验，重复3次，β-甘露聚糖酶酶活依次为39.92 U/mL、39.96 U/mL、39.97 U/mL，平均得油率为39.95 U/mL，因此该最佳工艺条件重复性良好。
3 讨论
研究发现，除了野油菜黄单孢菌、解甘露聚糖气杆菌等很少物种产生的β-甘露聚糖酶是以结构酶的形式结合在细胞膜或细胞壁上外，绝大多数β-甘露聚糖酶都是以诱导酶的形式存在的，培养基中添加少量的甘露多糖（如槐豆胶及其水解物、魔芋粉等）就可以显著提高β-甘露聚糖酶的产酶量[5]。本试验以槐豆胶为底物，采用DNS法测定β-甘露聚糖酶的酶活，确定重组β-甘露聚糖酶的最佳表达条件为：诱导温度60℃，诱导时间7小时和pH6.0，最佳诱导条件下，重组β-甘露聚糖酶的酶活达39.95U/mL，分别是枯草芽孢杆菌W B600、地衣芽孢杆菌w10中β-甘露聚糖酶基因在大肠杆菌中表达酶活的2.1倍和2.0倍[6]。此外，培养基组成和装液量也会影响到重组酶的表达，下一阶段的主要工作是在优化诱导温度、时间和pH条件下，研究重组酶表达的最佳培养基组成成分和装液量。
参考文献
[1]李剑芳，邬敏辰，夏文水.微生物β-甘露聚糖酶的研究进展[J].江苏食品与发酵，2004，118（03）：4-9.
[2]杨先芹，孙丹，杨文博，等.地衣芽孢杆菌NK-27菌株β-甘露聚糖酶的产酶条件及粗酶性质[J] .南开大学学报：自然科学版，2002，35（2）：117-120.
[3]蔺日胜.β-甘露聚糖酶基因整合诱导型表达载体的构建及在野生酵母菌中的表达[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2007.
[4]张龙翔，张文芳，李令援.生化实验方法和技术[M].北京：高教出版社，1997：140-142.
[5] Humberto Malheiros Ferreira， Edivaldo Ximenes Ferreira
Fi1ho.Purification and characterization of β-mannanase from Trichoderma harzianum strain T4[J].Carbohydrate Polymers，2004，57：23-29.
作者简介：王霞，硕士，吉林农业科技学院，讲师，研究方向：植物分子生物学及天然产物分离。
关键词：重组β-甘露聚糖酶；诱导条件优化；正交试验
项目基金：吉林农业科技学院校级微生物重点学科培育项目（编号：吉农院合字〔2013〕第X006 号）
中图分类号： G633.91 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.21.032
β-甘露聚糖酶（β-mannanase，EC.3.2.1.78），全称β-1，4-D-甘露聚糖酶，是作用于甘露聚糖β-1，4-D-甘露糖苷键的内切水解酶，它广泛存在于动物（如海洋软体动物的肠道分泌物）、植物（如豆类植物发芽的种子、魔芋萌发的球茎）和微生物（多种细菌、真菌和放线菌）中，其中微生物来源的β-甘露聚糖酶种类多、活性高、容易提取，是β-甘露聚糖酶的主要来源，也是该酶工业化生产的主要来源[1]。作为一种新型酶制剂，β-甘露聚糖酶广泛应用于食品、饲料、纺织、造纸、生物漂白、石油开采以及洗涤剂开发等领域，如在食品领域β-甘露聚糖酶可水解半乳糖甘露聚糖等多糖形成甘露寡糖，后者可用于改善人或动物肠道内的菌群环境，防止便秘或腹泻，在纺织领域，β-甘露聚糖酶可用于苎麻脱胶过程中半纤维素的降解，提高织物品质、减少能耗和环境污染等[2]。
目前，日本已经成功利用β-甘露聚糖酶生产瓜儿胶甘露寡糖，并研制出功能食品，美国chem gen公司也已生产出饲用酶制剂β-甘露聚糖酶[3]，而我国对β-甘露聚糖酶的研究还相对落后，在工业生产上缺少高质量的酶源，因此筛选和构建高产优质酶菌株、优化菌株产酶条件成为现阶段的研究热点。本试验首次以含有地衣芽孢杆菌ATCC14580 β-甘露聚糖酶基因的大肠杆菌BL21为试验材料，利用单因素试验和正交试验，优化重组大肠杆菌表达β-甘露聚糖酶的条件，为该酶的工业化生产奠定基础。
1材料与方法
1.1 试验材料
含有地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因的大肠杆菌BL21，由实验室制备。IPTG购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他试剂均为国产分析纯，培养基为常规LB培养基。
1.2 方法
1.2.1 工程菌的活化 将冻存的工程菌在含有卡那霉素的LB固体培养基中划线培养过夜，挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养过夜，37℃、180转/分钟。
1.2.2 单因素试验 将活化的工程菌接种于LB培养液中，加入0.5 mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达，利用单因素试验考察诱导时间、诱导温度以及pH对β-甘露聚糖酶酶活的影响，每组试验重复3次。
1.2.3 β-甘露聚糖酶酶活检测 参照《生化实验方法和技术》的方法，采用DNS法测定酶活，酶活性单位定义为：在实验反应条件下，1分钟水解得到1μmol还原糖所需要的酶量定义为1U，以酶活最高的为100%来计算相对酶活[4]。
1.2.4 正交试验优化 根据单因素试验结果，利用正交试验考察诱导时间、诱导温度和pH对工程菌重组酶活性的影响，每个因素选取3个水平，以相对酶活为考察指标，按照L9（33）正交表进行试验，考察因素表，见表1。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 诱导温度对β-甘露聚糖酶活性的影响 培养基中加入终浓度为0.5 mmolL IPTG诱导重组酶表达，分别设定诱导温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，诱导时间5小时，pH为6.0，诱导温度对β-甘露聚糖酶活性的影响如图1所示，可以看出，诱导温度在30℃～100℃范围内，β-甘露聚糖酶活性活性呈先升后降趋势，且温度为60℃时，β-甘露聚糖酶活性最高，为38.16 U/mL。
2.1.2 诱导时间对β-甘露聚糖酶活性的影响 为研究诱导时间对β-甘露聚糖酶活性的影响，设定诱导剂IPTG终浓度为0.5 mmolL，诱导温度60℃，pH为6.0，诱导时间分别设定为3、4、5、6、7、8、9、10小时，结果如图2所示，可以看出，诱导时间在3～10小时范围内，β-甘露聚糖酶活性活性呈先升后降趋势，且诱导时间为7h时，β-甘露聚糖酶活性活性最高，为39.93 U/mL。
2.1.3 pH对β-甘露聚糖酶活性的影响 为研究诱导pH对β-甘露聚糖酶活性的影响，设定诱导剂IPTG终浓度为0.5 mmolL，诱导温度60℃，诱导时间为7小时，pH分别设定为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，结果如图3所示，pH在4.0～9.0范围内，β-甘露聚糖酶活性活性呈先升后降趋势，且pH6.0时，β-甘露聚糖酶活性活性最高，为39.96 U/mL。
2.2 正交试验结果
R2 =0.984（调整R2=0.935）
正交试验及极差分析结果如表2所示，可以看出RC>RA>RB，即pH对β-甘露聚糖酶酶活性影响最大，诱导温度其次，诱导时间影响最小。表3为方差分析结果，可知pH和诱导温度对β-甘露聚糖酶酶活性影响显著，诱导时间影响不显著，影响程度与极差分析结果一致。综上，重组β-甘露聚糖酶最佳表达条件为A2B2C2，即诱导温度60℃，诱导时间7小时、pH 为6.0，在此条件下进行验证试验，重复3次，β-甘露聚糖酶酶活依次为39.92 U/mL、39.96 U/mL、39.97 U/mL，平均得油率为39.95 U/mL，因此该最佳工艺条件重复性良好。
3 讨论
研究发现，除了野油菜黄单孢菌、解甘露聚糖气杆菌等很少物种产生的β-甘露聚糖酶是以结构酶的形式结合在细胞膜或细胞壁上外，绝大多数β-甘露聚糖酶都是以诱导酶的形式存在的，培养基中添加少量的甘露多糖（如槐豆胶及其水解物、魔芋粉等）就可以显著提高β-甘露聚糖酶的产酶量[5]。本试验以槐豆胶为底物，采用DNS法测定β-甘露聚糖酶的酶活，确定重组β-甘露聚糖酶的最佳表达条件为：诱导温度60℃，诱导时间7小时和pH6.0，最佳诱导条件下，重组β-甘露聚糖酶的酶活达39.95U/mL，分别是枯草芽孢杆菌W B600、地衣芽孢杆菌w10中β-甘露聚糖酶基因在大肠杆菌中表达酶活的2.1倍和2.0倍[6]。此外，培养基组成和装液量也会影响到重组酶的表达，下一阶段的主要工作是在优化诱导温度、时间和pH条件下，研究重组酶表达的最佳培养基组成成分和装液量。
参考文献
[1]李剑芳，邬敏辰，夏文水.微生物β-甘露聚糖酶的研究进展[J].江苏食品与发酵，2004，118（03）：4-9.
[2]杨先芹，孙丹，杨文博，等.地衣芽孢杆菌NK-27菌株β-甘露聚糖酶的产酶条件及粗酶性质[J] .南开大学学报：自然科学版，2002，35（2）：117-120.
[3]蔺日胜.β-甘露聚糖酶基因整合诱导型表达载体的构建及在野生酵母菌中的表达[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2007.
[4]张龙翔，张文芳，李令援.生化实验方法和技术[M].北京：高教出版社，1997：140-142.
[5] Humberto Malheiros Ferreira， Edivaldo Ximenes Ferreira
Fi1ho.Purification and characterization of β-mannanase from Trichoderma harzianum strain T4[J].Carbohydrate Polymers，2004，57：23-29.
作者简介：王霞，硕士，吉林农业科技学院，讲师，研究方向：植物分子生物学及天然产物分离。