[目的]建立多重实时荧光PCR方法以检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。[方法]通过设计引物和探针,优化反应条件,建立多重实时PCR,检测金黄色葡萄球菌nuc基因、蜡样芽胞杆菌16SrRNA保守区基因及其ces基因(编码致呕毒素cereulide)。该多重实时荧光PCR方法检测23株金黄色葡萄球菌、4株蜡样芽胞杆菌菌株和6株乳杆菌,比较其与菌株鉴定结果及ces基因普通PCR检测结果。[结果]多重实时荧光PCR方法检测23株金黄色葡萄球菌、4株蜡样芽胞杆菌菌株和6株乳杆菌,与菌株鉴定结果的符合率为100%。蜡样芽胞杆菌的ces基因检测结果也与普通PCR结果相符。[结论]建立了同时检测金黄色葡萄球菌nuc、蜡样芽胞杆菌16s保守区基因及ces基因多重实时PCR方法,可应用于金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌在种水平上的菌株鉴定、以及蜡样芽胞杆菌cereulide毒力菌株的鉴定。