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【摘要】 目的：探讨结肠癌和直肠癌在癌变相关分子机制方面的异同。方法：选取本院2013年
1月-2014年12月30例结肠癌和30例直肠癌组织标本用于基因突变检测，分别设为结肠癌组与直肠癌组，各8例新鲜的结肠癌和直肠癌组织标本用于信号通路检测，比较不同标本的蛋白表达阳性率和信号通路。结果：两组APC、Wnt-1和p53基因蛋白表达情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。直肠癌组PSM2和MLH1蛋白表达阳性率均显著高于结肠癌组，比较差异均有统计学意义（P<0.01）；结肠癌组MSH2和MSH6蛋白表达阳性率均显著高于直肠癌组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结肠癌组K-ras突变率显著高于直肠癌组，比较差异有统计学意义（P=0.038）；结肠癌和直肠癌共有的信号通路为代谢通路、Wnt/β-catenin、血管平滑肌收缩通路、紧密连接通路和细胞周期通路，且这些通路相关的差异基因表达大部分；而轴突导向通路仅出现在直肠癌中，p53基因信号通路、药物代谢-细胞色素P450通路大量出现于结肠癌中。结论：结肠癌和直肠癌在癌变相关分子机制方面既有共性，也有个性：共性表现为Wnt信号通路、变异型p53蛋白和APC蛋白在二者癌变过程中发挥重要作用；个性表现为结肠癌中存在大量错配修复基因突变蛋白表达缺失，以PSM2和MLH1为主，而直肠癌以MSH2与MSH6为主。
【关键词】 结肠癌； 直肠癌； 分子机制
【Abstract】 Objective：To explore the similarities and differences between colon cancer and rectal cancer in oncogenesis molecular mechanism.Method：Each 30 cases of colon cancer and rectal cancer tissue specimens in our hospital from January 2013 to December 2014 were used for gene mutation detection，each eight fresh tissue specimens of colon cancer and rectal cancer were used for signaling pathways detection.The positive rate of protein expression and the signaling pathways of different specimens were compared.Result：The differences in protein expression of APC，Wnt-1 and p53 gene between the two groups were not statistically significant（P>0.05）.The positive rates of PSM2 and MLH1 protein expression in the rectal cancer group were higher than those in the colon cancer group，the differences were statistically significant（P<0.01）.The positive rates of MSH2 and MSH6 protein expression in the colon cancer group were higher than those in the rectal cancer group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The mutation rate of K-ras in the colon cancer group was higher than that in the rectal cancer group，the difference was statistically significant（P=0.038）.The common signal pathways of colon cancer and rectal cancer were metabolic pathway，Wnt/β-catenin，pathway of vascular smooth muscle contraction，closely connected pathway and cell cycle pathway.Most differential genes related to these pathways expressed.Axon guidance pathway appeared only in rectal cancer.Signaling pathway of p53 gene and drug metabolizing-cytochrome P450 pathway most appeared in colon cancer.Conclusion：Colon and rectal cancer have common and personal molecular mechanism.Their common manifestations show that Wnt signaling pathway，mutant p53 protein and APC protein play an important role in carcinogenesis process.Their individualitys show that presence of large mismatch repair gene mutations that cause protein loss mainly consists of PSM2 and MLH1 in colon cancer，but it mainly consists of MSH2 and MSH6 in rectal cancer. 【Key words】 Colon cancer； Rectal cancer； Molecular mechanism
First-author’s address：The Second People’s Hospital of Nanning City，Nanning 530031，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.05.021
结肠癌和直肠癌均为消化系统常见的肿瘤类型，其发病率随着人类生活的改善而逐渐升高，其死亡率位于恶性肿瘤的第4位[1]。我国流行病学调查表明二者的发病率和病因学方面存在显著差异，即结肠癌与人类生活习惯、饮食结构相关，直肠癌与地域、人种相关，故其在发生和发展中必然存在差异[2]。肿瘤的癌变机制通常为多基因改变、表达调控失调或传导路径变化造成，不同疾病癌变机制正处于研究中[3]。其中结肠癌和直肠癌癌变机制研究较为透彻，认为由其生长调控基因p53、K-ras和APC突变导致蛋白表达异常，进而引起正常上皮-管状腺瘤-绒毛状腺瘤-重度增生-肿瘤形成的癌变过程。尽管癌变机制研究较为清楚，但这类研究大部分针对结肠癌或捆绑二者一起研究，未区分二者，导致人们无法了解二者癌变过程和癌变机制的差别。本文对本院收治的患者进行基因突变检测和基因芯片检测，旨在探讨结肠癌和直肠癌在癌变分子机制方面的异同，为不同类型肿瘤的早期诊断和预防以及开展肿瘤筛查提供相应的理论参考，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取本院2013年1月-2014年
12月收治的30例结肠癌患者和30例直肠癌患者手术后的石蜡组织标本为基因突变检测对象，其中直肠癌组男15例，女15例，年龄50～70岁，平均（60.1±4.8）岁；结肠癌组男17例，女13例，年龄51～73岁，平均（61.1±5.1）岁。所有患者术后分期均为Duke B期，无淋巴结转移和远处转移。两组患者性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。基因芯片检测对象为直肠癌和结肠癌手术后新鲜冷冻的各8例组织样本，两组各含男4例，女4例，年龄50～70岁，平均（65.3±4.1）岁；结肠癌患者病变部位为升结肠，病理类型为中高分化腺癌，肿瘤分期为Duke B型，直肠癌患者病变部位为直肠，病理类型为中高分化腺癌，肿瘤分期为Duke B型，两组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 HE切片观测 在光镜下对各个标本的HE切片进行观测，其中包含1个正常的黏膜组织以及另外2个肿瘤组织。使用组织阵列仪做出9个组织芯片的蜡块，并将其放置在温度为4 ℃的冰箱中储存。把做好的组织芯片放置在切片机上制作出5 μm的连续切片，选出组织芯片较为完整的移到56 ℃的水中展开，并且用玻片将其捞出。之后采用免疫组织化学法进行染色处理，过程使用S-P法，按照试剂说明书进行。对各个指标的阳性以及阴性表达进行检测：CyclinD1以及Survivin在患者体内细胞核中定位，c-myc以及β-catenin、TCF4、PPARγ在细胞浆以及细胞核中进行定位，Wnt-1、MMP-7以及CD44v7在细胞浆中进行定位。依据阳性细胞数目以及着色的深度进行积分，每例进行5个高倍镜视野范围（×400）的随机观测。
1.2.2 基因突变检测 采用免疫组化方法检测APC、p53、Wnt-1、PSM2、MLH1、MSH2和MSH6蛋白水平[4]。具体操作方法：准备组织切片-脱蜡入水-PBS浸洗-热修复-PBS浸洗-灭活-加入牛血清-加入蛋白孵育-PBS浸洗-加入二抗工作液-PBS浸洗-DAB染色观察阳性结果-苏木复染，盐酸乙醇分化，热水反蓝，梯度乙醇脱水得中性数胶封片，观察。显微镜观察方法：随机选取10个视野，每视野含100个细胞观察。免疫组化阳性信号为棕黄色颗粒，观察染色强度和部位，并计数。具体染色结果判断参照文献进行。采用RT-PCR扩增，以获取其基因突变情况。
1.2.3 基因芯片检测 采用Human WG06v3.0 Expression BeadChip表达芯片进行。试验流程：提取RNA-合成cDNA-纯化并反转录-纯化并检测质量-与杂交试剂混合-孵育-洗涤-Block-观察信号-洗涤-干燥-获取图像数据。其中RNA的提取采用Trizol一步法进行[5]。RNA的扩增采用PCR进行[6]。所得数据采用marray软件可视化芯片数据，对其归一化后进行信号筛选[7]。
1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计分析软件对研究数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组癌变基因蛋白表达情况比较 两组APC、Wnt-1和p53基因蛋白表达情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）。错配修复基因表达蛋白检测后发现：直肠癌组PSM2和MLH1蛋白表达阳性率显著高于结肠癌组，比较差异有统计学意义（P<0.01）；结肠癌组MSH2和MSH6蛋白表达阳性率显著高于直肠癌组，比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 两组癌变基因比较 结肠癌组K-ras突变率高达60.0%（18/30），显著高于直肠癌组的33.3%（10/30），比较差异有统计学意义（ 字2=4.286，P=0.038）。
2.3 结肠癌与直肠癌癌变信号通路比较 结肠癌和直肠癌共有的信号通路为代谢通路、Wnt/β-catenin、血管平滑肌收缩通路、紧密连接通路和细胞周期通路，且这些通路相关的差异基因表达大部分；而轴突导向通路仅出现在直肠癌中，p53基因信号通路、药物代谢-细胞色素P450通路大量出现于结肠癌中。
1月-2014年12月30例结肠癌和30例直肠癌组织标本用于基因突变检测，分别设为结肠癌组与直肠癌组，各8例新鲜的结肠癌和直肠癌组织标本用于信号通路检测，比较不同标本的蛋白表达阳性率和信号通路。结果：两组APC、Wnt-1和p53基因蛋白表达情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。直肠癌组PSM2和MLH1蛋白表达阳性率均显著高于结肠癌组，比较差异均有统计学意义（P<0.01）；结肠癌组MSH2和MSH6蛋白表达阳性率均显著高于直肠癌组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结肠癌组K-ras突变率显著高于直肠癌组，比较差异有统计学意义（P=0.038）；结肠癌和直肠癌共有的信号通路为代谢通路、Wnt/β-catenin、血管平滑肌收缩通路、紧密连接通路和细胞周期通路，且这些通路相关的差异基因表达大部分；而轴突导向通路仅出现在直肠癌中，p53基因信号通路、药物代谢-细胞色素P450通路大量出现于结肠癌中。结论：结肠癌和直肠癌在癌变相关分子机制方面既有共性，也有个性：共性表现为Wnt信号通路、变异型p53蛋白和APC蛋白在二者癌变过程中发挥重要作用；个性表现为结肠癌中存在大量错配修复基因突变蛋白表达缺失，以PSM2和MLH1为主，而直肠癌以MSH2与MSH6为主。
【关键词】 结肠癌； 直肠癌； 分子机制
【Abstract】 Objective：To explore the similarities and differences between colon cancer and rectal cancer in oncogenesis molecular mechanism.Method：Each 30 cases of colon cancer and rectal cancer tissue specimens in our hospital from January 2013 to December 2014 were used for gene mutation detection，each eight fresh tissue specimens of colon cancer and rectal cancer were used for signaling pathways detection.The positive rate of protein expression and the signaling pathways of different specimens were compared.Result：The differences in protein expression of APC，Wnt-1 and p53 gene between the two groups were not statistically significant（P>0.05）.The positive rates of PSM2 and MLH1 protein expression in the rectal cancer group were higher than those in the colon cancer group，the differences were statistically significant（P<0.01）.The positive rates of MSH2 and MSH6 protein expression in the colon cancer group were higher than those in the rectal cancer group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The mutation rate of K-ras in the colon cancer group was higher than that in the rectal cancer group，the difference was statistically significant（P=0.038）.The common signal pathways of colon cancer and rectal cancer were metabolic pathway，Wnt/β-catenin，pathway of vascular smooth muscle contraction，closely connected pathway and cell cycle pathway.Most differential genes related to these pathways expressed.Axon guidance pathway appeared only in rectal cancer.Signaling pathway of p53 gene and drug metabolizing-cytochrome P450 pathway most appeared in colon cancer.Conclusion：Colon and rectal cancer have common and personal molecular mechanism.Their common manifestations show that Wnt signaling pathway，mutant p53 protein and APC protein play an important role in carcinogenesis process.Their individualitys show that presence of large mismatch repair gene mutations that cause protein loss mainly consists of PSM2 and MLH1 in colon cancer，but it mainly consists of MSH2 and MSH6 in rectal cancer. 【Key words】 Colon cancer； Rectal cancer； Molecular mechanism
First-author’s address：The Second People’s Hospital of Nanning City，Nanning 530031，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.05.021
结肠癌和直肠癌均为消化系统常见的肿瘤类型，其发病率随着人类生活的改善而逐渐升高，其死亡率位于恶性肿瘤的第4位[1]。我国流行病学调查表明二者的发病率和病因学方面存在显著差异，即结肠癌与人类生活习惯、饮食结构相关，直肠癌与地域、人种相关，故其在发生和发展中必然存在差异[2]。肿瘤的癌变机制通常为多基因改变、表达调控失调或传导路径变化造成，不同疾病癌变机制正处于研究中[3]。其中结肠癌和直肠癌癌变机制研究较为透彻，认为由其生长调控基因p53、K-ras和APC突变导致蛋白表达异常，进而引起正常上皮-管状腺瘤-绒毛状腺瘤-重度增生-肿瘤形成的癌变过程。尽管癌变机制研究较为清楚，但这类研究大部分针对结肠癌或捆绑二者一起研究，未区分二者，导致人们无法了解二者癌变过程和癌变机制的差别。本文对本院收治的患者进行基因突变检测和基因芯片检测，旨在探讨结肠癌和直肠癌在癌变分子机制方面的异同，为不同类型肿瘤的早期诊断和预防以及开展肿瘤筛查提供相应的理论参考，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取本院2013年1月-2014年
12月收治的30例结肠癌患者和30例直肠癌患者手术后的石蜡组织标本为基因突变检测对象，其中直肠癌组男15例，女15例，年龄50～70岁，平均（60.1±4.8）岁；结肠癌组男17例，女13例，年龄51～73岁，平均（61.1±5.1）岁。所有患者术后分期均为Duke B期，无淋巴结转移和远处转移。两组患者性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。基因芯片检测对象为直肠癌和结肠癌手术后新鲜冷冻的各8例组织样本，两组各含男4例，女4例，年龄50～70岁，平均（65.3±4.1）岁；结肠癌患者病变部位为升结肠，病理类型为中高分化腺癌，肿瘤分期为Duke B型，直肠癌患者病变部位为直肠，病理类型为中高分化腺癌，肿瘤分期为Duke B型，两组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 HE切片观测 在光镜下对各个标本的HE切片进行观测，其中包含1个正常的黏膜组织以及另外2个肿瘤组织。使用组织阵列仪做出9个组织芯片的蜡块，并将其放置在温度为4 ℃的冰箱中储存。把做好的组织芯片放置在切片机上制作出5 μm的连续切片，选出组织芯片较为完整的移到56 ℃的水中展开，并且用玻片将其捞出。之后采用免疫组织化学法进行染色处理，过程使用S-P法，按照试剂说明书进行。对各个指标的阳性以及阴性表达进行检测：CyclinD1以及Survivin在患者体内细胞核中定位，c-myc以及β-catenin、TCF4、PPARγ在细胞浆以及细胞核中进行定位，Wnt-1、MMP-7以及CD44v7在细胞浆中进行定位。依据阳性细胞数目以及着色的深度进行积分，每例进行5个高倍镜视野范围（×400）的随机观测。
1.2.2 基因突变检测 采用免疫组化方法检测APC、p53、Wnt-1、PSM2、MLH1、MSH2和MSH6蛋白水平[4]。具体操作方法：准备组织切片-脱蜡入水-PBS浸洗-热修复-PBS浸洗-灭活-加入牛血清-加入蛋白孵育-PBS浸洗-加入二抗工作液-PBS浸洗-DAB染色观察阳性结果-苏木复染，盐酸乙醇分化，热水反蓝，梯度乙醇脱水得中性数胶封片，观察。显微镜观察方法：随机选取10个视野，每视野含100个细胞观察。免疫组化阳性信号为棕黄色颗粒，观察染色强度和部位，并计数。具体染色结果判断参照文献进行。采用RT-PCR扩增，以获取其基因突变情况。
1.2.3 基因芯片检测 采用Human WG06v3.0 Expression BeadChip表达芯片进行。试验流程：提取RNA-合成cDNA-纯化并反转录-纯化并检测质量-与杂交试剂混合-孵育-洗涤-Block-观察信号-洗涤-干燥-获取图像数据。其中RNA的提取采用Trizol一步法进行[5]。RNA的扩增采用PCR进行[6]。所得数据采用marray软件可视化芯片数据，对其归一化后进行信号筛选[7]。
1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计分析软件对研究数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组癌变基因蛋白表达情况比较 两组APC、Wnt-1和p53基因蛋白表达情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）。错配修复基因表达蛋白检测后发现：直肠癌组PSM2和MLH1蛋白表达阳性率显著高于结肠癌组，比较差异有统计学意义（P<0.01）；结肠癌组MSH2和MSH6蛋白表达阳性率显著高于直肠癌组，比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 两组癌变基因比较 结肠癌组K-ras突变率高达60.0%（18/30），显著高于直肠癌组的33.3%（10/30），比较差异有统计学意义（ 字2=4.286，P=0.038）。
2.3 结肠癌与直肠癌癌变信号通路比较 结肠癌和直肠癌共有的信号通路为代谢通路、Wnt/β-catenin、血管平滑肌收缩通路、紧密连接通路和细胞周期通路，且这些通路相关的差异基因表达大部分；而轴突导向通路仅出现在直肠癌中，p53基因信号通路、药物代谢-细胞色素P450通路大量出现于结肠癌中。