论文部分内容阅读
摘要：目的 研究冰片对皮肤活性表皮作用方式，探究冰片作为经皮促透剂的促透作用机制。方法 选择常用经典化学经皮促透剂氮酮作为阳性对照促透剂，采用CCK-8试剂盒测定并计算冰片对HaCaT细胞的半数抑制率（IC50），利用荧光漂白恢复技术测定不同浓度冰片对HaCaT细胞膜流动性的影响，采用流式细胞仪测定冰片对HaCaT细胞膜电位及细胞膜内Ca2+浓度的影响。结果 冰片和氮酮的药物IC50分别为2.826、0.172 mmol/L；冰片可增加HaCaT细胞膜流动性，且随着药物浓度的增大而增加，呈剂量依赖性关系；冰片可降低HaCaT细胞膜电位和HaCaT细胞内Ca2+浓度，表现出类似氮酮作用特点。结论 冰片的经皮促透作用机制可能与其影响角质细胞内Ca2+浓度进而改变活性表皮角质形成细胞膜电位和膜流动性有关。
关键词：冰片；促透剂；细胞膜流动性；HaCaT细胞；细胞膜电位
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.018
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）04-0062-05
Effects of Borneol on Membrane Fluidity and Membrane Potential of HaCaT Cell FU Da-li1， YONG Xiao-lan1， LIU De-fang1， XIAO Shuang2 （1.General Hospital of Chengdu Military Region， Chengdu 610083， China；2.Sichuan Provincial People’s Hospital， Chengdu 610072， China）
Abstract：Objective To investigate the action mode of borneol on activity of epidermal skin；To investigate action mode of borneol as penetration enhancer. Methods The well-established and standard penetration enhancer Azone was employed as a positive control in this study. The cytotoxicities of borneol and Azone on HaCaT cells were detected by CCK-8 assay， and their half 50% inhibitory concentrations （IC50） were calculated. The fluorescence recovery after photo bleaching was employed to investigate the effect of borneol and Azone on membrane fluidity， and the flow cytometer was used to monitor the changes of membrane potential of HaCaT cell after treated with these penetration enhancers. Results The IC50 values of borneol and Azone were 2.826 ， 0.172 mmol/L， respectively. Borneol could significantly improve the membrane fluidity in a concentration-dependent manner， and effectively decrease the membrane potential of HaCaT cell， which exhibited the performances similar to those of Azone. Conclusion The penetration enhancement mechanism of borneol was associated with the concentrations of Ca2+ in keratinocytes， which changes the membrane fluidity and membrane potential of HaCaT cell.
Key words：borneol；penetration enhancer；membrane fluidity；HaCaT cell；membrane potential
基金项目：四川省卫生厅科研课题（120573）
的影响[J].放射免疫学杂志，2010，23（3）：282-283.
[5] 赵海梅，刘端勇，湯菲，等.四神丸对小鼠溃疡性结肠炎结肠黏膜修复的保护机制研究[J].中成药，2009，31（12）：1935-1937.
[6] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，2006：1088.
[7] 甘华田，欧阳钦，贾道全，等.溃疡性结肠炎患者核因子-κB活化与细胞因子基因表达[J].中华内科杂志，2002，41（4）：252-255.
[8] 张志军，王磊，蒋晓云，等.TLR4mAb对急性期溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的影响[J].复旦学报，2008， 35（2）：176-179.
[9] Abreu MT， Arnold ET， Thomas LS. TLR4 and MD-2 expression is regulated by immune-mediated signals in human intestinal epithelial cells[J]. The Journal of Biological Chemistry，2002， 277（23）：20431-20437. （收稿日期：2014-08-17）
（修回日期：2014-08-26；编辑：华强）
冰片属开窍药，具有辛香走窜之性，能引药由肌表直达腠理，在中药外用制剂中应用广泛，从而促进中药外用制剂中有效成分透皮吸收，表现出类似现代经皮制剂中的促透剂作用[1-2]。皮肤表皮作为药物经皮吸收的重要屏障，主要由角质层和活性表皮组成，关于冰片促透作用机制，有研究考察冰片对表皮角质层的影响[3-4]，但尚未阐明其对皮肤活性表皮的作用，目前也缺乏经皮促透剂对皮肤活性表皮的促透作用机制研究。因此，本研究采用HaCaT细胞模型，测定冰片对HaCaT细胞膜流动性和膜电位的影响，研究其对皮肤活性表皮的影响，为进一步阐明冰片促进药物透皮吸收的作用机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 药物与主要试剂
冰片，北京本草方源药业有限公司，批号20140422；胎牛血清，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号NXF0650；青链霉素混合液，北京索莱寶科技有限公司，批号20130318；MEM/EBSS，赛黙飞世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号NYC0831；胰蛋白酶-EDTA消化液，北京索莱宝科技有限公司，批号20130313；氮酮，国药集团化学试剂有限公司，批号F20110831；磷酸盐缓冲液（PBS），北京索莱宝科技有限公司，批号20130531；Invitrogen Incorporation，批号1313498；细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8）， Dojindo，批号EJ744；Fluo3-AM，Dojindo，批号EX767；DiBAC4（3）荧光探针。
1.2 仪器
Multiskan GO全波长酶标仪（芬兰Thermo公司），FV1000激光共聚焦扫描显微镜（日本奥林巴斯公司），BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪（美国DB公司）。
1.3 细胞株与细胞培养
HaCaT细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。将HaCaT细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青链霉素混合液的MEM/EBSS培养基中，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件培养。
1.4 CCK-8法测定冰片HaCaT细胞毒性
收集对数期HaCaT细胞，以每孔7.0×103的细胞密度接种于96孔板，并设置空白组（PBS）、对照组（含0.5%DMSO培养基）及系列药物组，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后，加入系列不同浓度冰片及阳性对照药氮酮。药物作用24 h后移去培养基，加入1 mL含10 μL CCK-8试液培养基，置于37 ℃培养箱中反应2 h。于酶标仪450 nm处检测各孔的吸光度（A），并计算细胞存活率[（A药物组-A空白组）÷（A对照组-A空白组）×100%]。根据系列不同浓度药物细胞存活率及文献方法，计算药物半数抑制率（IC50）[5]。
1.5 细胞膜流动性的测定
利用激光共聚焦显微镜的荧光漂白恢复技术（FRAP）观察并测定药物作用HaCaT细胞后对细胞膜流动性的影响。以每孔15×104的细胞密度接种于激光共聚焦培养小皿，并设置空白组（正常培养基）、对照组（含0.5%DMSO培养基）及高、中、低浓度冰片和氮酮药物组。置于培养箱内培养24 h后，移去培养基，并用PBS小心清洗3遍，每孔加入0.5 mL 2 μL/mL NBD-C6-HPC荧光探针溶液培养0.5 h，然后再用PBS小心清洗3遍，置于激光共聚焦显微镜进行测定。仪器参数为：激发波长488 nm，接收波长530 nm，荧光漂白的激光功率100%，漂白时间900 ms，扫描频率1.65 s，总扫描时间为120 s。记录荧光漂白位置荧光漂白动画，细胞膜流动性以荧光恢复率进行表征。荧光恢复率（%）=（F2-F1）÷（F1-F0）×100%。式中，F2为荧光漂白后的荧光值，F1为荧光漂白前的荧光值。F0为漂白后即刻荧光值荧光恢复率越大，细胞膜流动性越大。
1.6 细胞膜电位的测定
采用流式细胞仪测定冰片及阳性药氮酮对HaCaT细胞膜电位的影响。将HaCaT细胞接种于25 mL培养瓶内，设置空白组（正常培养基）、对照组（含0.5% DMSO培养基）及高、中、低浓度冰片和氮酮药物组，待细胞贴壁后12 h分别加入对应药物，置CO2培养箱孵育24 h。用胰蛋白酶消化、离心，去除上清液后加入500 μL DiBAC4（3）荧光探针溶液（5 μg/mL），37 ℃孵育0.5 h，离心后弃上清液，用0.5 mL PBS分散后利用流式细胞仪进行细胞膜电位测定。仪器参数设置：激发波长488 nm，接收波长 530 nm，用未经荧光物质孵育HaCaT细胞调零。
1.7 HaCaT细胞内Ca2+浓度的测定
将HaCaT细胞接种于25 mL培养瓶内，并设置空白组（正常培养基）、对照组（含0.5% DMSO培养基）、及高、中、低浓度冰片和氮酮药物组，待细胞贴壁后分别加入对应的药物培养24 h。然后用胰蛋白酶消化，D-Hanks溶液稀释并调整细胞密度为70×104/孔，离心去上清液，加入0.5 mL Fluo 3-AM （5 μmol），置培养箱孵育0.5 h后，采用流式细胞仪进行测定HaCaT细胞荧光强度。仪器参数设置：激发波长488 nm，接收波长520 nm。
1.8 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 冰片对HaCaT细胞存活率的影响
冰片和氮酮对HaCaT细胞存活率的影响大致呈浓度依赖性关系，根据细胞存活率计算冰片和氮酮IC50，分别为（2.826±0.261）、（0.172±0.003）mmol/L，见图1。结果表明，相对于常用化学经皮促透剂氮酮，冰片具有较低的细胞毒性，提示冰片作为经皮促透剂可能具有较低的皮肤刺激性。其中，当冰片和氮酮浓度分别低于0.312、0.039 mmol/L时，对HaCaT细胞活性影响较低，因此，选择0.300、0.200、0.100 mmol/L冰片及0.050、0.025、0.001 mmol/L氮酮分别作为高、中、低浓度考察其对HaCaT细胞膜流动性和膜电位的影响。 2.2 冰片對HaCaT细胞膜流动性的影响
采用荧光探针作用后激光共聚焦的荧光图像，测定HaCaT细胞膜流动性之前先在细胞上选定荧光漂白部位（小圈），荧光漂白前可见HaCaT细胞膜荧光呈绿色且分布较为均匀，在利用激光漂白瞬间漂白部位的绿色荧光消失，然后由于细胞膜存在流动性，漂白周围的荧光随着细胞膜的流动性转移到漂白区域，一段时间后，漂白部位荧光会有一定程度的恢复（见图2）。同时，在漂白前到荧光恢复前记录漂白区域内荧光强度值并得出荧光恢复曲线（见图3）。然后，根据漂白区域内荧光漂白前后的荧光强度值计算细胞膜荧光恢复率，从而测定细胞膜流动性的大小。
由表1所知，正常HaCaT细胞膜的荧光恢复率为42.3%，以0.5%DMSO为溶剂的对照组的荧光恢复率为44.6%，说明采用0.5%DMSO作为冰片和氮酮溶剂对细胞膜流动性没有显著影响。在不同浓度氮酮作用下，细胞膜流动性均显著增加（P<0.05），且随氮酮应用浓度增加表现出细胞膜流动性增加作用。而在冰片作用下，HaCaT细胞膜流动性增加，且呈浓度依赖性，随浓度增加而加强，表现出与化学促透剂氮酮相似的作用特点，表明冰片可增加HaCaT细胞膜流动性。
2.3 冰片对HaCaT细胞膜电位的影响
HaCaT细胞静息状态下，细胞膜内呈负电荷，膜外带正电，从而在HaCaT细胞膜内外形成一定电势差，荧光探针可在此电势差作用下进行跨膜转运。当细胞膜内外电势差变弱时，转运荧光物质相应减少，因此，可根据荧光探针荧光强度值判断相应物质对细胞膜电位的影响。值得注意的是，DiBAC4（3）为带负电荷探针，利用该荧光探针检测到的荧光强度值越大，表明细胞膜表面电位越低[7]。
图4为冰片高浓度组作用下流式细胞仪测定的HaCaT细胞膜电位代表图谱，由表2可知，空白组与对照组荧光强度值未表现出明显差异（P>0.05），说明0.5%DMSO作为冰片和氮酮溶剂对HaCaT细胞膜电位没有显著影响。而在中、高浓度氮酮作用下，所检测的HaCaT细胞荧光值显著增加，说明该浓度氮酮作用下HaCaT细胞膜电位降低，而低浓度氮酮未对HaCaT细胞膜电位产生影响。同样，根据高、中、低浓度冰片对HaCaT细胞膜荧光值可知，低浓度冰片也未对HaCaT细胞膜电位产生显著影响，但随着冰片浓度增加，HaCaT细胞膜电位显著降低，表现出类似氮酮的作用方式，提示冰片具有降低HaCaT细胞膜电位作用。
2.4 冰片对HaCaT细胞内Ca2+浓度的影响
分别给予高、中、低浓度冰片（3个浓度值的设置同细胞膜电位和流动性试验），荧光强度值的变化反映细胞内Ca2+浓度的变化，从而测定冰片对细胞内Ca2+浓度的影响。图5为冰片低浓度组作用下流式细胞仪测定的HaCaT细胞内Ca2+浓度的代表图谱。空白组与对照组荧光强度值未表现出显著差异（P>0.05），说明0.5%DMSO作为冰片和氮酮溶剂对细胞Ca2+浓度没有显著影响。由表3可知，高、中、低浓度氮酮作用下，HaCaT细胞Ca2+荧光强度值均显著降低，提示氮酮可降低细胞内Ca2+浓度，而低浓度冰片对HaCaT细胞内Ca2+浓度未产生显著影响，但随着冰片浓度值的增加，荧光强度值降低，表现出类似氮酮的作用特点，说明冰片可降低HaCaT细胞内Ca2+浓度。
3 讨论
皮肤主要由表皮、真皮和皮下组织组成，由于真皮层上部存在丰富的毛细血管网，药物通透到达真皮后就很快被吸收，因此，皮肤表皮是药物经皮吸收的主要通透屏障。皮肤表皮由外向内可分为5层，即角质层、透明层、粒层、棘层和基层，其中，除已角化的角质层外，其他各层统称为活性表皮。表皮实际上包含两类细胞，即角质形成细胞（keratinocyte，约占95%）和非角质形成细胞（包括黑素细胞、朗格汉斯细胞以及梅克尔细胞等）。而HaCaT细胞作为一种重要的人表皮角质形成细胞，目前已成为外用透皮用药研究的一种重要模型[6]。因此，本研究采用HaCaT角质形成细胞模型研究冰片对皮肤活性表皮的影响。此外，氮酮作为经典的常用化学经皮促透剂，已在医药和化妆品行业中作为皮肤渗透促进剂得到广泛应用，也是经皮促透剂促透效果评价的常用参照促透剂[7]，因此，本实验选择氮酮对比研究冰片对HaCaT角质形成细胞作用特点。
细胞膜内的脂质和蛋白分子具有一定流动性，细胞膜流动性的改变常伴随着许多细胞功能的变化，如物质跨膜转运、膜结合酶活性、配体与膜受体的结合、细胞的分化与细胞识别等方面[8]。相关研究也表明，一些经皮促透剂可通过影响皮肤表皮角质细胞膜流动性，从而增强皮肤表皮细胞间流动性，利于药物的透皮转运吸收[6]。本研究结果提示，冰片具有增加角质形成细胞膜流动性作用，表现出与化学促透剂相似的作用特点，提示冰片可通过增加皮肤表皮细胞间流动性，从而降低药物通透皮肤表皮的屏障作用。
细胞膜电位也是细胞膜最重要的生物物理学特征之一，其形成与细胞膜上各种离子泵的存在有关，在细胞膜内外有一定的离子浓度差，从而形成电势差。细胞膜电位的改变常伴随着相关细胞膜脂功能和结构的改变，如膜黏度、膜厚度、离子渗透等[9-10]。Hamman等[11]研究报告指出，皮肤表皮类似于上皮组织细胞，在细胞的紧密连接处存在一定负电荷。而一些经皮促透剂可与这些负电荷产生一定相互作用，是其促进药物向透皮吸收或向皮肤深层转动的作用机制之一[6，12]。本研究结果显示，冰片也具有降低表皮角质形成细胞膜电位作用，可能通过影响皮肤表面负电荷而改变皮肤活性表皮屏障作用，有利于药物透过皮肤活性表皮层。
Ca2+作为细胞最古老、作用最广泛的细胞信使之一，在人皮肤角质细胞增殖、分化等生理生化反应中均具有重要的调节作用[13]，而细胞内外Ca2+平衡被打破，将会改变角质细胞的膜流动性及其紧密连接程度、膜电位等[14]。本研究结果发现，冰片及氮酮作用下，HaCaT细胞内Ca2+浓度都显著降低，提示冰片增加表皮角质形成细胞膜流动性、降低细胞膜电位，可能与其对细胞内外Ca2+平衡影响有关，但相关作用机制有待进一步研究。 本实验研究结果表明，冰片作为天然的经皮促透剂不仅可影响表皮最外层角质层的屏障作用，还可影响角质形成细胞膜流动性和膜电位等降低皮肤活性表皮屏障功能，从而有利于药物的经皮吸收。同时，本实验采用HaCaT细胞作为促透剂促渗机制研究模型，考察冰片对其细胞膜流动性和膜电位的影响，探索冰片促进药物透皮吸收的相关作用机制，也为深入阐明经皮促透剂作用机制的研究提供新的思路和方法。
参考文献：
[1] 袁志曌，邢建峰，黄新亮，等.冰片对白斑霜中氟尿嘧啶和地塞米松体外透皮作用的研究[J].中药材，2009，32（8）：1295-1297.
[2] 王晓颖，叶梦屏.3种促透剂对钩藤体外透皮吸收的影响[J].中国现代应用药学，2010，27（7）：623-625.
[3] 孙静静，陈俊红，方光远，等.冰片作为涂膜剂促透剂对小鼠经皮给药后皮肤上皮细胞超微结构观察[J].畜牧与兽医，2014，46（5）：77-78.
[4] 宇克莉，孙建华.几种透皮吸收促进剂的作用机理探讨[J].山东医药， 2007，47（11）：30-31.
[5] Xiang W， Gao A， Liang H， et al. Reversal of P-glycoprotein- mediated multidrug resistance in vitro by milbemycin compounds in adriamycin-resistant human breast carcinoma （Mcf-7/Adr） cells[J]. Toxicology in Vitro，2010，24（6）：1474-1481.
[6] He W， Guo X， Xiao L， et al. Study on the mechanisms of chitosan and its derivatives used as transdermal penetration enhancers[J]. International Journal of Pharmaceutics，2009，382（1/2）：234-243.
[7] Batheja P， Sheihet L， Kohn J， et al. Topical drug delivery by a polymeric nanosphere gel：formulation optimization and in vitro and in vivo skin distribution studies[J]. Journal of Controlled Release，2011，149（2）：159-167.
[8] 糜漫天，朱錫华.膜脂质结构变化对淋巴细胞跨膜膜电位的影响[J].免疫学杂志，1996，12（3）：172-176.
[9] Zbytovská J， Raudenkolb S， Wartewig S， et al. Phase behaviour of transkarbam 12[J]. Chemistry and Physics of Lipids，2004， 129（1）：97-109.
[10] Thanou M， Verhoef J， Junginger H. Oral drug absorption enhancement by chitosan and its derivatives[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2001，52（2）：117-126.
[11] Hamman JH， Stander M， Kotzé AF. Effect of the degree of quaternisation of N-trimethyl chitosan chloride on absorption enhancement：in vivo evaluation in rat nasal epithelia[J]. International Journal of Pharmaceutics，2002，232（1/2）：235-242.
[12] Taveira SF， Nomizo A， Lopez RF. Effect of the iontophoresis of a chitosan gel on doxorubicin skin penetration and cytotoxicity[J]. Journal of Controlled Release，2009，134（1）：35-40.
[13] 孙强，柴家科，梁黎明，等.Ca2+对角质形成细胞增殖与分化调控的作用研究[J].中国美容医学，2007，16（9）：1181-1184.
[14] 梁庆.薄荷醇的促透作用及其机制研究[D].广州：广东药学院，2009.
（收稿日期：2014-09-16；编辑：华强）
关键词：冰片；促透剂；细胞膜流动性；HaCaT细胞；细胞膜电位
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.018
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）04-0062-05
Effects of Borneol on Membrane Fluidity and Membrane Potential of HaCaT Cell FU Da-li1， YONG Xiao-lan1， LIU De-fang1， XIAO Shuang2 （1.General Hospital of Chengdu Military Region， Chengdu 610083， China；2.Sichuan Provincial People’s Hospital， Chengdu 610072， China）
Abstract：Objective To investigate the action mode of borneol on activity of epidermal skin；To investigate action mode of borneol as penetration enhancer. Methods The well-established and standard penetration enhancer Azone was employed as a positive control in this study. The cytotoxicities of borneol and Azone on HaCaT cells were detected by CCK-8 assay， and their half 50% inhibitory concentrations （IC50） were calculated. The fluorescence recovery after photo bleaching was employed to investigate the effect of borneol and Azone on membrane fluidity， and the flow cytometer was used to monitor the changes of membrane potential of HaCaT cell after treated with these penetration enhancers. Results The IC50 values of borneol and Azone were 2.826 ， 0.172 mmol/L， respectively. Borneol could significantly improve the membrane fluidity in a concentration-dependent manner， and effectively decrease the membrane potential of HaCaT cell， which exhibited the performances similar to those of Azone. Conclusion The penetration enhancement mechanism of borneol was associated with the concentrations of Ca2+ in keratinocytes， which changes the membrane fluidity and membrane potential of HaCaT cell.
Key words：borneol；penetration enhancer；membrane fluidity；HaCaT cell；membrane potential
基金项目：四川省卫生厅科研课题（120573）
的影响[J].放射免疫学杂志，2010，23（3）：282-283.
[5] 赵海梅，刘端勇，湯菲，等.四神丸对小鼠溃疡性结肠炎结肠黏膜修复的保护机制研究[J].中成药，2009，31（12）：1935-1937.
[6] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，2006：1088.
[7] 甘华田，欧阳钦，贾道全，等.溃疡性结肠炎患者核因子-κB活化与细胞因子基因表达[J].中华内科杂志，2002，41（4）：252-255.
[8] 张志军，王磊，蒋晓云，等.TLR4mAb对急性期溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的影响[J].复旦学报，2008， 35（2）：176-179.
[9] Abreu MT， Arnold ET， Thomas LS. TLR4 and MD-2 expression is regulated by immune-mediated signals in human intestinal epithelial cells[J]. The Journal of Biological Chemistry，2002， 277（23）：20431-20437. （收稿日期：2014-08-17）
（修回日期：2014-08-26；编辑：华强）
冰片属开窍药，具有辛香走窜之性，能引药由肌表直达腠理，在中药外用制剂中应用广泛，从而促进中药外用制剂中有效成分透皮吸收，表现出类似现代经皮制剂中的促透剂作用[1-2]。皮肤表皮作为药物经皮吸收的重要屏障，主要由角质层和活性表皮组成，关于冰片促透作用机制，有研究考察冰片对表皮角质层的影响[3-4]，但尚未阐明其对皮肤活性表皮的作用，目前也缺乏经皮促透剂对皮肤活性表皮的促透作用机制研究。因此，本研究采用HaCaT细胞模型，测定冰片对HaCaT细胞膜流动性和膜电位的影响，研究其对皮肤活性表皮的影响，为进一步阐明冰片促进药物透皮吸收的作用机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 药物与主要试剂
冰片，北京本草方源药业有限公司，批号20140422；胎牛血清，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号NXF0650；青链霉素混合液，北京索莱寶科技有限公司，批号20130318；MEM/EBSS，赛黙飞世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号NYC0831；胰蛋白酶-EDTA消化液，北京索莱宝科技有限公司，批号20130313；氮酮，国药集团化学试剂有限公司，批号F20110831；磷酸盐缓冲液（PBS），北京索莱宝科技有限公司，批号20130531；Invitrogen Incorporation，批号1313498；细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8）， Dojindo，批号EJ744；Fluo3-AM，Dojindo，批号EX767；DiBAC4（3）荧光探针。
1.2 仪器
Multiskan GO全波长酶标仪（芬兰Thermo公司），FV1000激光共聚焦扫描显微镜（日本奥林巴斯公司），BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪（美国DB公司）。
1.3 细胞株与细胞培养
HaCaT细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。将HaCaT细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青链霉素混合液的MEM/EBSS培养基中，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件培养。
1.4 CCK-8法测定冰片HaCaT细胞毒性
收集对数期HaCaT细胞，以每孔7.0×103的细胞密度接种于96孔板，并设置空白组（PBS）、对照组（含0.5%DMSO培养基）及系列药物组，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后，加入系列不同浓度冰片及阳性对照药氮酮。药物作用24 h后移去培养基，加入1 mL含10 μL CCK-8试液培养基，置于37 ℃培养箱中反应2 h。于酶标仪450 nm处检测各孔的吸光度（A），并计算细胞存活率[（A药物组-A空白组）÷（A对照组-A空白组）×100%]。根据系列不同浓度药物细胞存活率及文献方法，计算药物半数抑制率（IC50）[5]。
1.5 细胞膜流动性的测定
利用激光共聚焦显微镜的荧光漂白恢复技术（FRAP）观察并测定药物作用HaCaT细胞后对细胞膜流动性的影响。以每孔15×104的细胞密度接种于激光共聚焦培养小皿，并设置空白组（正常培养基）、对照组（含0.5%DMSO培养基）及高、中、低浓度冰片和氮酮药物组。置于培养箱内培养24 h后，移去培养基，并用PBS小心清洗3遍，每孔加入0.5 mL 2 μL/mL NBD-C6-HPC荧光探针溶液培养0.5 h，然后再用PBS小心清洗3遍，置于激光共聚焦显微镜进行测定。仪器参数为：激发波长488 nm，接收波长530 nm，荧光漂白的激光功率100%，漂白时间900 ms，扫描频率1.65 s，总扫描时间为120 s。记录荧光漂白位置荧光漂白动画，细胞膜流动性以荧光恢复率进行表征。荧光恢复率（%）=（F2-F1）÷（F1-F0）×100%。式中，F2为荧光漂白后的荧光值，F1为荧光漂白前的荧光值。F0为漂白后即刻荧光值荧光恢复率越大，细胞膜流动性越大。
1.6 细胞膜电位的测定
采用流式细胞仪测定冰片及阳性药氮酮对HaCaT细胞膜电位的影响。将HaCaT细胞接种于25 mL培养瓶内，设置空白组（正常培养基）、对照组（含0.5% DMSO培养基）及高、中、低浓度冰片和氮酮药物组，待细胞贴壁后12 h分别加入对应药物，置CO2培养箱孵育24 h。用胰蛋白酶消化、离心，去除上清液后加入500 μL DiBAC4（3）荧光探针溶液（5 μg/mL），37 ℃孵育0.5 h，离心后弃上清液，用0.5 mL PBS分散后利用流式细胞仪进行细胞膜电位测定。仪器参数设置：激发波长488 nm，接收波长 530 nm，用未经荧光物质孵育HaCaT细胞调零。
1.7 HaCaT细胞内Ca2+浓度的测定
将HaCaT细胞接种于25 mL培养瓶内，并设置空白组（正常培养基）、对照组（含0.5% DMSO培养基）、及高、中、低浓度冰片和氮酮药物组，待细胞贴壁后分别加入对应的药物培养24 h。然后用胰蛋白酶消化，D-Hanks溶液稀释并调整细胞密度为70×104/孔，离心去上清液，加入0.5 mL Fluo 3-AM （5 μmol），置培养箱孵育0.5 h后，采用流式细胞仪进行测定HaCaT细胞荧光强度。仪器参数设置：激发波长488 nm，接收波长520 nm。
1.8 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 冰片对HaCaT细胞存活率的影响
冰片和氮酮对HaCaT细胞存活率的影响大致呈浓度依赖性关系，根据细胞存活率计算冰片和氮酮IC50，分别为（2.826±0.261）、（0.172±0.003）mmol/L，见图1。结果表明，相对于常用化学经皮促透剂氮酮，冰片具有较低的细胞毒性，提示冰片作为经皮促透剂可能具有较低的皮肤刺激性。其中，当冰片和氮酮浓度分别低于0.312、0.039 mmol/L时，对HaCaT细胞活性影响较低，因此，选择0.300、0.200、0.100 mmol/L冰片及0.050、0.025、0.001 mmol/L氮酮分别作为高、中、低浓度考察其对HaCaT细胞膜流动性和膜电位的影响。 2.2 冰片對HaCaT细胞膜流动性的影响
采用荧光探针作用后激光共聚焦的荧光图像，测定HaCaT细胞膜流动性之前先在细胞上选定荧光漂白部位（小圈），荧光漂白前可见HaCaT细胞膜荧光呈绿色且分布较为均匀，在利用激光漂白瞬间漂白部位的绿色荧光消失，然后由于细胞膜存在流动性，漂白周围的荧光随着细胞膜的流动性转移到漂白区域，一段时间后，漂白部位荧光会有一定程度的恢复（见图2）。同时，在漂白前到荧光恢复前记录漂白区域内荧光强度值并得出荧光恢复曲线（见图3）。然后，根据漂白区域内荧光漂白前后的荧光强度值计算细胞膜荧光恢复率，从而测定细胞膜流动性的大小。
由表1所知，正常HaCaT细胞膜的荧光恢复率为42.3%，以0.5%DMSO为溶剂的对照组的荧光恢复率为44.6%，说明采用0.5%DMSO作为冰片和氮酮溶剂对细胞膜流动性没有显著影响。在不同浓度氮酮作用下，细胞膜流动性均显著增加（P<0.05），且随氮酮应用浓度增加表现出细胞膜流动性增加作用。而在冰片作用下，HaCaT细胞膜流动性增加，且呈浓度依赖性，随浓度增加而加强，表现出与化学促透剂氮酮相似的作用特点，表明冰片可增加HaCaT细胞膜流动性。
2.3 冰片对HaCaT细胞膜电位的影响
HaCaT细胞静息状态下，细胞膜内呈负电荷，膜外带正电，从而在HaCaT细胞膜内外形成一定电势差，荧光探针可在此电势差作用下进行跨膜转运。当细胞膜内外电势差变弱时，转运荧光物质相应减少，因此，可根据荧光探针荧光强度值判断相应物质对细胞膜电位的影响。值得注意的是，DiBAC4（3）为带负电荷探针，利用该荧光探针检测到的荧光强度值越大，表明细胞膜表面电位越低[7]。
图4为冰片高浓度组作用下流式细胞仪测定的HaCaT细胞膜电位代表图谱，由表2可知，空白组与对照组荧光强度值未表现出明显差异（P>0.05），说明0.5%DMSO作为冰片和氮酮溶剂对HaCaT细胞膜电位没有显著影响。而在中、高浓度氮酮作用下，所检测的HaCaT细胞荧光值显著增加，说明该浓度氮酮作用下HaCaT细胞膜电位降低，而低浓度氮酮未对HaCaT细胞膜电位产生影响。同样，根据高、中、低浓度冰片对HaCaT细胞膜荧光值可知，低浓度冰片也未对HaCaT细胞膜电位产生显著影响，但随着冰片浓度增加，HaCaT细胞膜电位显著降低，表现出类似氮酮的作用方式，提示冰片具有降低HaCaT细胞膜电位作用。
2.4 冰片对HaCaT细胞内Ca2+浓度的影响
分别给予高、中、低浓度冰片（3个浓度值的设置同细胞膜电位和流动性试验），荧光强度值的变化反映细胞内Ca2+浓度的变化，从而测定冰片对细胞内Ca2+浓度的影响。图5为冰片低浓度组作用下流式细胞仪测定的HaCaT细胞内Ca2+浓度的代表图谱。空白组与对照组荧光强度值未表现出显著差异（P>0.05），说明0.5%DMSO作为冰片和氮酮溶剂对细胞Ca2+浓度没有显著影响。由表3可知，高、中、低浓度氮酮作用下，HaCaT细胞Ca2+荧光强度值均显著降低，提示氮酮可降低细胞内Ca2+浓度，而低浓度冰片对HaCaT细胞内Ca2+浓度未产生显著影响，但随着冰片浓度值的增加，荧光强度值降低，表现出类似氮酮的作用特点，说明冰片可降低HaCaT细胞内Ca2+浓度。
3 讨论
皮肤主要由表皮、真皮和皮下组织组成，由于真皮层上部存在丰富的毛细血管网，药物通透到达真皮后就很快被吸收，因此，皮肤表皮是药物经皮吸收的主要通透屏障。皮肤表皮由外向内可分为5层，即角质层、透明层、粒层、棘层和基层，其中，除已角化的角质层外，其他各层统称为活性表皮。表皮实际上包含两类细胞，即角质形成细胞（keratinocyte，约占95%）和非角质形成细胞（包括黑素细胞、朗格汉斯细胞以及梅克尔细胞等）。而HaCaT细胞作为一种重要的人表皮角质形成细胞，目前已成为外用透皮用药研究的一种重要模型[6]。因此，本研究采用HaCaT角质形成细胞模型研究冰片对皮肤活性表皮的影响。此外，氮酮作为经典的常用化学经皮促透剂，已在医药和化妆品行业中作为皮肤渗透促进剂得到广泛应用，也是经皮促透剂促透效果评价的常用参照促透剂[7]，因此，本实验选择氮酮对比研究冰片对HaCaT角质形成细胞作用特点。
细胞膜内的脂质和蛋白分子具有一定流动性，细胞膜流动性的改变常伴随着许多细胞功能的变化，如物质跨膜转运、膜结合酶活性、配体与膜受体的结合、细胞的分化与细胞识别等方面[8]。相关研究也表明，一些经皮促透剂可通过影响皮肤表皮角质细胞膜流动性，从而增强皮肤表皮细胞间流动性，利于药物的透皮转运吸收[6]。本研究结果提示，冰片具有增加角质形成细胞膜流动性作用，表现出与化学促透剂相似的作用特点，提示冰片可通过增加皮肤表皮细胞间流动性，从而降低药物通透皮肤表皮的屏障作用。
细胞膜电位也是细胞膜最重要的生物物理学特征之一，其形成与细胞膜上各种离子泵的存在有关，在细胞膜内外有一定的离子浓度差，从而形成电势差。细胞膜电位的改变常伴随着相关细胞膜脂功能和结构的改变，如膜黏度、膜厚度、离子渗透等[9-10]。Hamman等[11]研究报告指出，皮肤表皮类似于上皮组织细胞，在细胞的紧密连接处存在一定负电荷。而一些经皮促透剂可与这些负电荷产生一定相互作用，是其促进药物向透皮吸收或向皮肤深层转动的作用机制之一[6，12]。本研究结果显示，冰片也具有降低表皮角质形成细胞膜电位作用，可能通过影响皮肤表面负电荷而改变皮肤活性表皮屏障作用，有利于药物透过皮肤活性表皮层。
Ca2+作为细胞最古老、作用最广泛的细胞信使之一，在人皮肤角质细胞增殖、分化等生理生化反应中均具有重要的调节作用[13]，而细胞内外Ca2+平衡被打破，将会改变角质细胞的膜流动性及其紧密连接程度、膜电位等[14]。本研究结果发现，冰片及氮酮作用下，HaCaT细胞内Ca2+浓度都显著降低，提示冰片增加表皮角质形成细胞膜流动性、降低细胞膜电位，可能与其对细胞内外Ca2+平衡影响有关，但相关作用机制有待进一步研究。 本实验研究结果表明，冰片作为天然的经皮促透剂不仅可影响表皮最外层角质层的屏障作用，还可影响角质形成细胞膜流动性和膜电位等降低皮肤活性表皮屏障功能，从而有利于药物的经皮吸收。同时，本实验采用HaCaT细胞作为促透剂促渗机制研究模型，考察冰片对其细胞膜流动性和膜电位的影响，探索冰片促进药物透皮吸收的相关作用机制，也为深入阐明经皮促透剂作用机制的研究提供新的思路和方法。
参考文献：
[1] 袁志曌，邢建峰，黄新亮，等.冰片对白斑霜中氟尿嘧啶和地塞米松体外透皮作用的研究[J].中药材，2009，32（8）：1295-1297.
[2] 王晓颖，叶梦屏.3种促透剂对钩藤体外透皮吸收的影响[J].中国现代应用药学，2010，27（7）：623-625.
[3] 孙静静，陈俊红，方光远，等.冰片作为涂膜剂促透剂对小鼠经皮给药后皮肤上皮细胞超微结构观察[J].畜牧与兽医，2014，46（5）：77-78.
[4] 宇克莉，孙建华.几种透皮吸收促进剂的作用机理探讨[J].山东医药， 2007，47（11）：30-31.
[5] Xiang W， Gao A， Liang H， et al. Reversal of P-glycoprotein- mediated multidrug resistance in vitro by milbemycin compounds in adriamycin-resistant human breast carcinoma （Mcf-7/Adr） cells[J]. Toxicology in Vitro，2010，24（6）：1474-1481.
[6] He W， Guo X， Xiao L， et al. Study on the mechanisms of chitosan and its derivatives used as transdermal penetration enhancers[J]. International Journal of Pharmaceutics，2009，382（1/2）：234-243.
[7] Batheja P， Sheihet L， Kohn J， et al. Topical drug delivery by a polymeric nanosphere gel：formulation optimization and in vitro and in vivo skin distribution studies[J]. Journal of Controlled Release，2011，149（2）：159-167.
[8] 糜漫天，朱錫华.膜脂质结构变化对淋巴细胞跨膜膜电位的影响[J].免疫学杂志，1996，12（3）：172-176.
[9] Zbytovská J， Raudenkolb S， Wartewig S， et al. Phase behaviour of transkarbam 12[J]. Chemistry and Physics of Lipids，2004， 129（1）：97-109.
[10] Thanou M， Verhoef J， Junginger H. Oral drug absorption enhancement by chitosan and its derivatives[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2001，52（2）：117-126.
[11] Hamman JH， Stander M， Kotzé AF. Effect of the degree of quaternisation of N-trimethyl chitosan chloride on absorption enhancement：in vivo evaluation in rat nasal epithelia[J]. International Journal of Pharmaceutics，2002，232（1/2）：235-242.
[12] Taveira SF， Nomizo A， Lopez RF. Effect of the iontophoresis of a chitosan gel on doxorubicin skin penetration and cytotoxicity[J]. Journal of Controlled Release，2009，134（1）：35-40.
[13] 孙强，柴家科，梁黎明，等.Ca2+对角质形成细胞增殖与分化调控的作用研究[J].中国美容医学，2007，16（9）：1181-1184.
[14] 梁庆.薄荷醇的促透作用及其机制研究[D].广州：广东药学院，2009.
（收稿日期：2014-09-16；编辑：华强）