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【摘 要】 目的：对白芨ISSR-PCR反应体系进行建立以及优化。方法：采用正交试验对影响白芨的ISSR-PCR反应体系中的6个影响因素Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+进行系统的筛选和优化，寻找白芨ISSR-PCR的最优条件。结果：经过系统的优化后，最终确立了最优的白芨ISSR-PCR方案，50 μL反应液中Taq DNA聚合酶为2.5U、BSA为7.5g/L、引物为5.0μmoL/L、模板DNA为200ng、dNTP为0.4mmoL/L、Mg2+为4.0mmoL/L。结论：试验结果得出最佳的白芨ISSR-PCR反应体系，为后期合理有效的应用ISSR方法对白芨遗传资源的监测提供了参考。
【关键词】 白芨；ISSR-PCR反应体系；单因素试验；正交试验
【中图分类号】R284 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）24-0028-03
白芨属兰科，其性味甘、苦、涩，微寒，主要归经于肺[1]。白芨现已成为濒临灭绝的珍贵物种，对白芨遗传资源的分类保护已成为人类研究的重大课题之一[2]。ISSR是近年来新兴的一种分子标记技术，在植物遗传资源的保育工作中已得到普及使用[3]。PCR扩增为ISSR的关键技术，主要受到6个因素的影响（Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+）[4]。研究采用单因素试验以及正交试验对影响白芨的ISSR-PCR反应体系中的6个影响因素进行优化，寻找白芨ISSR-PCR反应体系的最优条件。
1 材料与方法
1.1 材料 白芨购自同仁堂，购得的白芨放置在干燥阴凉处储存。
1.2 主要试剂与仪器 Taq DNA聚合酶、dNTP、100 bp DNA Ladder、BSA、Mg2+均购自克劳宁（北京）生物科技有限公司。PCR扩增仪（PTC.200，美国MJ公司）、核酸检测仪（Bio Photometer，美国Eppendoff公司）。
1.3 方法
1.3.1 DNA的提取 白芨基因组DNA的提取方法为改进的CTAB法，并用核酸检测仪测定获得的DNA浓度，并用蒸馏水稀释浓度为0.05g/L，放置在-20℃冰箱中储存。
1.3.2 PCR扩增反应条件及其产物检测 参考预实验结果，退火温度选择52℃，PCR扩增反应条件如下：4min预变性于94℃条件下，30s变性于94℃条件下，1min退火于52℃条件下，90s延伸于72℃条件下，共重复35次操作。取6μL所获得的PCR扩增产物，行1h的电脉操作。用100 bp DNA Ladder作为参照物，1×TAE为缓冲液，5 V/cm恒压条件，琼脂糖凝胶为2.0%。
1.3.3 优化方法 正交设计选取L25（56）的方案，反应液为50μL，结果见表1。由正交实验得到的结果，选取数目多且清晰条带的组合。
1.3.4 正交实验的验证实验 按照优化后的方法行三次ISSR-PCR反应，分析所测定的条带情况。
2 结果
2.1 正交实验结果 6因素5水平的正交设计共产生25个扩增产物，结果见表2。Taq DNA：由电脉图分析可得，当Taq DNA为2.5U时条带数目最多，且最清晰。BSA：由组别4的条件得到的电脉图分析可知，选择7.5g/L为BSA的最优浓度。引物：从正交试验结果可知，当引物浓度为5.0 μmoL/L时电脉图条带数目最多、最清晰。DNA模板：按不同的浓度进行加样，其它因素均设为正交试验的最优条件，由电脉图可知，200ng为最适浓度。dNTP及Mg2+：分别按不同的浓度进行加样，其它因素均设为正交试验的最优条件，分析图谱，得出最优值。
2.2 正交实验直观分析及方差分析 由表2、3可知，最优的白芨ISSR-PCR方案，50μL反应液中Taq DNA聚合酶为2.5 U、BSA为7.5g/L、引物为5.0μmoL/L、模板DNA为200ng、dNTP为0.4mmoL/L、Mg2+为4.0mmoL/L。结果分别见表2、表3。
2.3 正交实验的验证实验结果分析 正交实验的验证实验结果表明，优化后的方案稳定、可行。具体结果见表4。
3 讨论
白芨具有消肿止痛以及收敛止血的功效，临床主要用于肺结核，百日咳，矽肺，十二指肠溃疡急性穿孔，十二指肠溃疡出血等疾病的治疗[5]。如今，白芨已成为濒危物种，对其进行有效的育种至关重要，加之不同的白芨很难采用形态特征进行区分，而分子标记技术对遗传资源的保育十分重要[6]。随着科技的进步，人类对生物体的认识已经上升到微观水平。通过测定微观分子的水平的线性结构（如DNA序列），来横向比较不同物种的差异[7]。ISSR简单易行，普遍应用于物种区分、遗传资源保育等领域。具有检测成功率高、成本较低等特点。ISSR技术可在预先不知序列信息的前提下，能够仅用一条引物以及基因组中众多的简单重复序列就可以进行PCR扩增[8]。
PCR扩增为ISSR的重要技术，主要的影响因素为Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+。故每个白芨物种都要制定不一样的ISSR-PCR条件。由于单因素试验对所考察的因素水平进行逐一分析，任务量过大，操作过于繁琐，且无法考察各因素相互的影响作用，故本研究不予单独采用。正交试验可全面考察各因素之间的相互影响作用，且能分析各因素之间的轻重次序。正交试验的缺点为测定结果精密度较差，且对技术水平要求过高。正交试验与单因素试验具有互补的作用，故本研究将两者结合的试验方法进行优化。最终对影响ISSR-PCR反应体系的Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+因素进行系统筛选，得到了最优的反应条件（50 μL反应液中Taq DNA聚合酶为2.5 U、BSA为7.5g/L、引物为5.0μmoL/L、模板DNA为200ng、dNTP为0.4mmoL/L、Mg2+为4.0mmoL/L）。本实验在不设重复时，试验随机误差分散式隐含在正交表各列之中，由于随机误差与模型误差相对混杂，而且较大，至使F检验的误差均方差相对较大。
综上所述，试验结果得出最佳的白芨ISSR-PCR条件，为ISSR技术在白芨物种鉴别方面提供了实验依据。
参考文献
[1]卓微伟. 中药白芨的药理作用及临床应用的研究进展[J]. 北方药学， 2014，（11）：69.
[2]陈灿， 陈海霞. 白芨繁殖研究进展[J]. 湖南农业科学， 2015，（5）：135-137.
[3]王建波. ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J]. 遗传， 2002， 24（5）：613-616.
[4]余艳， 陈海山， 葛学军. 简单重复序列区间（ISSR）引物反应条件优化与筛选[J]. 热带亚热带植物学报， 2003， 11（1）：15-19.
[5]陶阿麗， 金耀东， 刘金旗，等. 中药白芨化学成分、药理作用及临床应用研究进展[J]. 江苏农业科学， 2013，（11）：6-9.
[6]和志娇， 吕丽芬， 杨丽云，等. 白芨种质资源遗传多样性的ISSR分析[J]. 西南农业学报， 2008， 21（4）：1081-1085.
[7]郭峰. 分子生物学技术及与其他学科的关系[J]. 河南科技， 2011，（4）：9.
[8]刘亭， 金露， 兰波，等. 白芨ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]. 贵阳医学院学报， 2014， 39（4）：455-458.
（编辑：陶希睿）
【关键词】 白芨；ISSR-PCR反应体系；单因素试验；正交试验
【中图分类号】R284 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）24-0028-03
白芨属兰科，其性味甘、苦、涩，微寒，主要归经于肺[1]。白芨现已成为濒临灭绝的珍贵物种，对白芨遗传资源的分类保护已成为人类研究的重大课题之一[2]。ISSR是近年来新兴的一种分子标记技术，在植物遗传资源的保育工作中已得到普及使用[3]。PCR扩增为ISSR的关键技术，主要受到6个因素的影响（Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+）[4]。研究采用单因素试验以及正交试验对影响白芨的ISSR-PCR反应体系中的6个影响因素进行优化，寻找白芨ISSR-PCR反应体系的最优条件。
1 材料与方法
1.1 材料 白芨购自同仁堂，购得的白芨放置在干燥阴凉处储存。
1.2 主要试剂与仪器 Taq DNA聚合酶、dNTP、100 bp DNA Ladder、BSA、Mg2+均购自克劳宁（北京）生物科技有限公司。PCR扩增仪（PTC.200，美国MJ公司）、核酸检测仪（Bio Photometer，美国Eppendoff公司）。
1.3 方法
1.3.1 DNA的提取 白芨基因组DNA的提取方法为改进的CTAB法，并用核酸检测仪测定获得的DNA浓度，并用蒸馏水稀释浓度为0.05g/L，放置在-20℃冰箱中储存。
1.3.2 PCR扩增反应条件及其产物检测 参考预实验结果，退火温度选择52℃，PCR扩增反应条件如下：4min预变性于94℃条件下，30s变性于94℃条件下，1min退火于52℃条件下，90s延伸于72℃条件下，共重复35次操作。取6μL所获得的PCR扩增产物，行1h的电脉操作。用100 bp DNA Ladder作为参照物，1×TAE为缓冲液，5 V/cm恒压条件，琼脂糖凝胶为2.0%。
1.3.3 优化方法 正交设计选取L25（56）的方案，反应液为50μL，结果见表1。由正交实验得到的结果，选取数目多且清晰条带的组合。
1.3.4 正交实验的验证实验 按照优化后的方法行三次ISSR-PCR反应，分析所测定的条带情况。
2 结果
2.1 正交实验结果 6因素5水平的正交设计共产生25个扩增产物，结果见表2。Taq DNA：由电脉图分析可得，当Taq DNA为2.5U时条带数目最多，且最清晰。BSA：由组别4的条件得到的电脉图分析可知，选择7.5g/L为BSA的最优浓度。引物：从正交试验结果可知，当引物浓度为5.0 μmoL/L时电脉图条带数目最多、最清晰。DNA模板：按不同的浓度进行加样，其它因素均设为正交试验的最优条件，由电脉图可知，200ng为最适浓度。dNTP及Mg2+：分别按不同的浓度进行加样，其它因素均设为正交试验的最优条件，分析图谱，得出最优值。
2.2 正交实验直观分析及方差分析 由表2、3可知，最优的白芨ISSR-PCR方案，50μL反应液中Taq DNA聚合酶为2.5 U、BSA为7.5g/L、引物为5.0μmoL/L、模板DNA为200ng、dNTP为0.4mmoL/L、Mg2+为4.0mmoL/L。结果分别见表2、表3。
2.3 正交实验的验证实验结果分析 正交实验的验证实验结果表明，优化后的方案稳定、可行。具体结果见表4。
3 讨论
白芨具有消肿止痛以及收敛止血的功效，临床主要用于肺结核，百日咳，矽肺，十二指肠溃疡急性穿孔，十二指肠溃疡出血等疾病的治疗[5]。如今，白芨已成为濒危物种，对其进行有效的育种至关重要，加之不同的白芨很难采用形态特征进行区分，而分子标记技术对遗传资源的保育十分重要[6]。随着科技的进步，人类对生物体的认识已经上升到微观水平。通过测定微观分子的水平的线性结构（如DNA序列），来横向比较不同物种的差异[7]。ISSR简单易行，普遍应用于物种区分、遗传资源保育等领域。具有检测成功率高、成本较低等特点。ISSR技术可在预先不知序列信息的前提下，能够仅用一条引物以及基因组中众多的简单重复序列就可以进行PCR扩增[8]。
PCR扩增为ISSR的重要技术，主要的影响因素为Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+。故每个白芨物种都要制定不一样的ISSR-PCR条件。由于单因素试验对所考察的因素水平进行逐一分析，任务量过大，操作过于繁琐，且无法考察各因素相互的影响作用，故本研究不予单独采用。正交试验可全面考察各因素之间的相互影响作用，且能分析各因素之间的轻重次序。正交试验的缺点为测定结果精密度较差，且对技术水平要求过高。正交试验与单因素试验具有互补的作用，故本研究将两者结合的试验方法进行优化。最终对影响ISSR-PCR反应体系的Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+因素进行系统筛选，得到了最优的反应条件（50 μL反应液中Taq DNA聚合酶为2.5 U、BSA为7.5g/L、引物为5.0μmoL/L、模板DNA为200ng、dNTP为0.4mmoL/L、Mg2+为4.0mmoL/L）。本实验在不设重复时，试验随机误差分散式隐含在正交表各列之中，由于随机误差与模型误差相对混杂，而且较大，至使F检验的误差均方差相对较大。
综上所述，试验结果得出最佳的白芨ISSR-PCR条件，为ISSR技术在白芨物种鉴别方面提供了实验依据。
参考文献
[1]卓微伟. 中药白芨的药理作用及临床应用的研究进展[J]. 北方药学， 2014，（11）：69.
[2]陈灿， 陈海霞. 白芨繁殖研究进展[J]. 湖南农业科学， 2015，（5）：135-137.
[3]王建波. ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J]. 遗传， 2002， 24（5）：613-616.
[4]余艳， 陈海山， 葛学军. 简单重复序列区间（ISSR）引物反应条件优化与筛选[J]. 热带亚热带植物学报， 2003， 11（1）：15-19.
[5]陶阿麗， 金耀东， 刘金旗，等. 中药白芨化学成分、药理作用及临床应用研究进展[J]. 江苏农业科学， 2013，（11）：6-9.
[6]和志娇， 吕丽芬， 杨丽云，等. 白芨种质资源遗传多样性的ISSR分析[J]. 西南农业学报， 2008， 21（4）：1081-1085.
[7]郭峰. 分子生物学技术及与其他学科的关系[J]. 河南科技， 2011，（4）：9.
[8]刘亭， 金露， 兰波，等. 白芨ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]. 贵阳医学院学报， 2014， 39（4）：455-458.
（编辑：陶希睿）