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摘要：目的 建立高效液相色谱法（HPLC）测定含油脂类药材中低分子羰基化合物的方法。方法 苦杏仁等药材经水提取，在酸性条件下，经2，4-二硝基苯肼（DNPH）衍生后，衍生物直接用HPLC测定。色谱柱：Kromasil KR100-5 C18 （250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：A为水-乙腈-四氢呋南-异丙醇（59∶30∶10∶1），B为水-乙腈（35∶65），梯度洗脱；流速：0.8 mL/min；检测波长：365 nm；柱温：30 ℃。结果 甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生物在一定浓度范围内与峰面积线性关系良好，相关系数均达到0.999以上，平均回收率为88.49%～93.65%，最低检测限为0.002～0.008 ?g/mL。结论 该方法简便、灵敏、准确、重复性较好。
关键词：柱前衍生化；低分子羰基化合物；高效液相色谱法；2，4-二硝基苯肼
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.017
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0046-03
1995年版《中华人民共和国药典》（一部）首次收载了酸败度检查法，此后历版药典均有收载[1-3]，其中羰基值测定的方法为比色法，测定原理为：在酸性条件下，羰基化合物与2，4-二硝基苯肼（DNPH）反应，生成2，4-二硝基苯腙，再与氢氧化钾作用，生成酒红色共振型离子，在453 nm波长下，测定吸光度，计算出样品中的羰基值。
比色法的准确性及重现性差，影响因素较多[4-5]，其中2，4-二硝基苯肼溶液加入量的准确性、测定方法的反应条件、所用试剂的杂质等直接影响该方法的准确性。另外，该方法使用溶剂量大，毒性大，且操作繁琐、时间长等因素，不仅影响结果准确性，且效率低下、不环保。本研究拟克服现有测定方法的弊端和不足，以建立客观、专属的测定方法，对羰基值测定方法
进行探索研究。考虑到酸败的产物中主要生成低分子的醛类、酮类化合物，本研究建立含油脂类中药材中甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、丁酮和丁醛等羰基化合物衍生物的高效液相色谱（HPLC）测定方法，为控制本类产品质量提供依据。
1 仪器与试药
Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（日本岛津），XS205电子天平（梅特勒-托利多仪器有限责任公司），KQ-300E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），TW20恒温水浴锅（Julabo仪器公司）。
乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生化合物（批号189048，纯度分别为99.9%、99.7%、98.0%、95.0%、99.9%、99.0%、99.0%、99.5%，上海安谱试剂公司）。
苦杏仁（批号130205）、炒苦杏仁（批号130214）、桃仁（批
号121220）、燀桃仁（批号130105），均购自北京绿野饮片公司。经鉴定，分别来源于蔷薇科植物杏Prunus armeniaca L.及山桃Prunus davidiana （Carr.） Franch.的干燥成熟种子。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱：Kromasil KR100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；以水-乙腈-四氢呋南-异丙醇（59∶30∶10∶1）为流动相A，以水-乙腈（35∶65）为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：365 nm；进样量10 ?L。在上述色谱条件下，各色谱峰分离良好，测定组分均能达到基线分离（见图1）。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生物对照品适量，加乙腈制成每1 mL各含0.02 mg的混合溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备
精密称取药材粉末15 g，精密称定，加水30 mL，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）1 h，离心，精密吸取澄清液10 mL至25 mL具塞刻度管中，精密加入1 mL 3.0 g/L的DNPH溶液、4 mL醋酸盐缓冲溶液（pH 4.8），加乙腈至刻度，在40 ℃恒温水浴锅中水浴加热90 min，取出放至室温，滤过，取续滤液，即得。
2.4 线性关系考察
分别精密称取甲醛DNPH衍生物对照品50.67 mg、乙醛DNPH衍生物对照品49.12 mg、丙酮DNPH衍生物对照品49.60 mg、丙烯醛DNPH衍生物对照品49.14 mg、丙醛DNPH衍生物对照品49.14 mg、巴豆醛DNPH衍生物对照品51.18 mg、2-丁酮DNPH衍生物对照品48.91 mg，丁醛DNPH衍生物对照品49.20 mg，置100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，得到对照品储备液。精密吸取1.0 mL置25 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度。分别精密吸取此混合对照溶液1、2、5、10、15、20、30 ?L，注入高效液相色谱仪，按色谱条件测定，以进样量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表2。
1.甲醛DNPH衍生物；2.乙醛DNPH衍生物；3.丙酮DNPH衍生物；
4.丙烯醛DNPH衍生物；5.丙醛DNPH衍生物；6.巴豆醛DNPH衍生物；
7.2-丁酮DNPH衍生物；8.丁醛DNPH衍生物
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液，连续进样6次，每次进样10 ?L，测定各峰峰面积，计算得甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生化合物RSD分别为0.07%、1.2%、0.26%、0.11%、0.48%、0.40%、1.9%、0.58%。 2.6 稳定性试验
取混合对照品溶液，在室温下贮存，每隔一定时间进样1次，每次10 ?L，测定各峰面积，计算得甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生化合物RSD的分别为0.16%、4.7%、0.35%、0.27%、2.8%、3.0%、0.48%、3.6%。结果表明，对照品溶液中8种化合物在8 h内均具有良好的稳定性。
2.7 检出限和定量限
以信噪比（S/N）为3作为检出限（LOD），信噪比为10作为定量限（LOQ），8种化学组分的检出限和定量限结果见表3。
2.8 加样回收率试验
取苦杏仁药材，研细，分别加入8种对照品，加甲醇溶解，平行制备6份，测定，结果见表4。
2.9 样品含量测定
分别取苦杏仁（批号130205）、炒苦杏仁（批号130214）、桃仁（批号121220）、燀桃仁（批号130105）等样品粉末15 g，按上述方法进行测定，计算含量，结果见表5。
3 讨论
本研究对《中华人民共和国药典》附录中酸败度测定项下供试液的测定方法进行了改进，原方法先用索氏提取法提取油脂，再用比色法测定油脂中的羰基值。因甲醛等小分子醛、酮类化合物易溶于水，因此，本研究采用药材直接以水超声提取、衍生化，用HPLC直接测定的方法，操作更简便，且液相测定方法比原紫外方法影响因素更小。用所建立的方法对常用含油脂类药材中小分子羰基化合物含量进行了测定，结果表明，乙醛、甲醛和丁醛是该类药材中含量较多的羰基化合物，其中，乙醛的含量更高。
本研究对衍生化条件进行了比较优化，包括溶液的pH值范围、反应温度和衍生化时间等，最终确定在弱酸性缓冲液条件下，40 ℃水浴加热90 min即可。
油脂发生酸败的结果是产生了一些小分子的醛酮类化合物，但通过测定该类化合物含量能否准确地反映或代表样品酸败的程度，有待进一步探讨。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：化学工业出版社，1995：附录59.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：化学工业出版社，2000：附录59.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录56.
[4] 裘汉幸.对《中国药典》酸败度检查法中羰基值测定方法的探讨[J].中国药事，1998，12（2）：98-99.
[5] 闰雪生，李霞，徐新刚，等.柏子仁霜脂肪油酸败度检查中羰基值测定方法的探讨[J].中国实用医药，2009，4（3O）：114-115.
（收稿日期：2013-06-21，编辑：陈静）
关键词：柱前衍生化；低分子羰基化合物；高效液相色谱法；2，4-二硝基苯肼
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.017
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0046-03
1995年版《中华人民共和国药典》（一部）首次收载了酸败度检查法，此后历版药典均有收载[1-3]，其中羰基值测定的方法为比色法，测定原理为：在酸性条件下，羰基化合物与2，4-二硝基苯肼（DNPH）反应，生成2，4-二硝基苯腙，再与氢氧化钾作用，生成酒红色共振型离子，在453 nm波长下，测定吸光度，计算出样品中的羰基值。
比色法的准确性及重现性差，影响因素较多[4-5]，其中2，4-二硝基苯肼溶液加入量的准确性、测定方法的反应条件、所用试剂的杂质等直接影响该方法的准确性。另外，该方法使用溶剂量大，毒性大，且操作繁琐、时间长等因素，不仅影响结果准确性，且效率低下、不环保。本研究拟克服现有测定方法的弊端和不足，以建立客观、专属的测定方法，对羰基值测定方法
进行探索研究。考虑到酸败的产物中主要生成低分子的醛类、酮类化合物，本研究建立含油脂类中药材中甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、丁酮和丁醛等羰基化合物衍生物的高效液相色谱（HPLC）测定方法，为控制本类产品质量提供依据。
1 仪器与试药
Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（日本岛津），XS205电子天平（梅特勒-托利多仪器有限责任公司），KQ-300E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），TW20恒温水浴锅（Julabo仪器公司）。
乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生化合物（批号189048，纯度分别为99.9%、99.7%、98.0%、95.0%、99.9%、99.0%、99.0%、99.5%，上海安谱试剂公司）。
苦杏仁（批号130205）、炒苦杏仁（批号130214）、桃仁（批
号121220）、燀桃仁（批号130105），均购自北京绿野饮片公司。经鉴定，分别来源于蔷薇科植物杏Prunus armeniaca L.及山桃Prunus davidiana （Carr.） Franch.的干燥成熟种子。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱：Kromasil KR100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；以水-乙腈-四氢呋南-异丙醇（59∶30∶10∶1）为流动相A，以水-乙腈（35∶65）为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：365 nm；进样量10 ?L。在上述色谱条件下，各色谱峰分离良好，测定组分均能达到基线分离（见图1）。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生物对照品适量，加乙腈制成每1 mL各含0.02 mg的混合溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备
精密称取药材粉末15 g，精密称定，加水30 mL，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）1 h，离心，精密吸取澄清液10 mL至25 mL具塞刻度管中，精密加入1 mL 3.0 g/L的DNPH溶液、4 mL醋酸盐缓冲溶液（pH 4.8），加乙腈至刻度，在40 ℃恒温水浴锅中水浴加热90 min，取出放至室温，滤过，取续滤液，即得。
2.4 线性关系考察
分别精密称取甲醛DNPH衍生物对照品50.67 mg、乙醛DNPH衍生物对照品49.12 mg、丙酮DNPH衍生物对照品49.60 mg、丙烯醛DNPH衍生物对照品49.14 mg、丙醛DNPH衍生物对照品49.14 mg、巴豆醛DNPH衍生物对照品51.18 mg、2-丁酮DNPH衍生物对照品48.91 mg，丁醛DNPH衍生物对照品49.20 mg，置100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，得到对照品储备液。精密吸取1.0 mL置25 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度。分别精密吸取此混合对照溶液1、2、5、10、15、20、30 ?L，注入高效液相色谱仪，按色谱条件测定，以进样量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表2。
1.甲醛DNPH衍生物；2.乙醛DNPH衍生物；3.丙酮DNPH衍生物；
4.丙烯醛DNPH衍生物；5.丙醛DNPH衍生物；6.巴豆醛DNPH衍生物；
7.2-丁酮DNPH衍生物；8.丁醛DNPH衍生物
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液，连续进样6次，每次进样10 ?L，测定各峰峰面积，计算得甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生化合物RSD分别为0.07%、1.2%、0.26%、0.11%、0.48%、0.40%、1.9%、0.58%。 2.6 稳定性试验
取混合对照品溶液，在室温下贮存，每隔一定时间进样1次，每次10 ?L，测定各峰面积，计算得甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生化合物RSD的分别为0.16%、4.7%、0.35%、0.27%、2.8%、3.0%、0.48%、3.6%。结果表明，对照品溶液中8种化合物在8 h内均具有良好的稳定性。
2.7 检出限和定量限
以信噪比（S/N）为3作为检出限（LOD），信噪比为10作为定量限（LOQ），8种化学组分的检出限和定量限结果见表3。
2.8 加样回收率试验
取苦杏仁药材，研细，分别加入8种对照品，加甲醇溶解，平行制备6份，测定，结果见表4。
2.9 样品含量测定
分别取苦杏仁（批号130205）、炒苦杏仁（批号130214）、桃仁（批号121220）、燀桃仁（批号130105）等样品粉末15 g，按上述方法进行测定，计算含量，结果见表5。
3 讨论
本研究对《中华人民共和国药典》附录中酸败度测定项下供试液的测定方法进行了改进，原方法先用索氏提取法提取油脂，再用比色法测定油脂中的羰基值。因甲醛等小分子醛、酮类化合物易溶于水，因此，本研究采用药材直接以水超声提取、衍生化，用HPLC直接测定的方法，操作更简便，且液相测定方法比原紫外方法影响因素更小。用所建立的方法对常用含油脂类药材中小分子羰基化合物含量进行了测定，结果表明，乙醛、甲醛和丁醛是该类药材中含量较多的羰基化合物，其中，乙醛的含量更高。
本研究对衍生化条件进行了比较优化，包括溶液的pH值范围、反应温度和衍生化时间等，最终确定在弱酸性缓冲液条件下，40 ℃水浴加热90 min即可。
油脂发生酸败的结果是产生了一些小分子的醛酮类化合物，但通过测定该类化合物含量能否准确地反映或代表样品酸败的程度，有待进一步探讨。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：化学工业出版社，1995：附录59.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：化学工业出版社，2000：附录59.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录56.
[4] 裘汉幸.对《中国药典》酸败度检查法中羰基值测定方法的探讨[J].中国药事，1998，12（2）：98-99.
[5] 闰雪生，李霞，徐新刚，等.柏子仁霜脂肪油酸败度检查中羰基值测定方法的探讨[J].中国实用医药，2009，4（3O）：114-115.
（收稿日期：2013-06-21，编辑：陈静）