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摘要：目的 观察四妙勇安汤合生脉饮对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞细胞凋亡的影响，探讨其心肌细胞保护作用。方法 采用胰蛋白和胶原酶联合消化的方法原代培养的SD乳鼠心肌细胞，利用高纯氮气建立心肌细胞缺氧/复氧模型。实验分为正常组、模型组和药物干预组（予四妙勇安汤合生脉饮）。采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测心肌细胞凋亡率。结果 与正常组比较，模型组及药物干预组心肌细胞凋亡率均升高（P<0.05）。与模型组比较，药物干预组心肌细胞凋亡率下降（P<0.05）。结论 四妙勇安汤合生脉饮对缺氧/复氧后心肌细胞凋亡有保护作用。
关键词：四妙勇安汤；生脉饮；心肌细胞凋亡；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0035-03
近年来实验研究显示四妙勇安汤具有抗动脉粥样硬化、保护血管新生的作用[1]，部分临床试验表明四妙勇安汤加味对冠心病以及急性心肌梗死患者疗效确切[2-3]。生脉饮临床主要用于冠心病、心肌梗死、心力衰竭及各种休克的治疗。四妙勇安汤合生脉饮是否能够起到保护心肌细胞的作用，是否通过参与细胞凋亡影响心肌细胞活性，相关报道很少。因此，本研究观察四妙勇安汤合生脉饮对心肌细胞凋亡的影响。
1 实验材料
1.1 动物
SD乳鼠，出生24 h以内，SPF级，雌雄不限，购于河北医科大学实验动物中心，动物合格证号：1308037。
1.2 药物
四妙勇安汤合生脉饮药物组成：金银花30 g，玄参30 g，当归15 g，甘草6 g，人参9 g，麦冬9 g，五味子6 g。石家庄
市中医院中药房提供。
1.3 主要试剂与仪器
胰蛋白酶（美国Sigma），DMEM/F12（美国Gibco），Ⅱ型胶原酶（美国Sigma），胎牛血清（奥地利PAA），5-溴脱氧尿嘧啶（Brdu，美国Sigma），α-Actin兔单克隆抗体（美国Epitomics），兔免疫组化试剂盒（北京四正柏），AnnexinⅤ-PI双染试剂盒（MultiSciences）等。311型CO2恒温培养箱（美国Thermo公司），AIRTEC-vs型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），Olympus-IX71倒置相差显微镜（日本OLYMPUS）， Olympus光学显微镜（日本OLYMPUS），流式细胞仪（美国Beckman），低速离心机（北京医用离心机厂）。
2 实验方法
2.1 四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液的制备
按原方准确称取每味中药（金银花30 g，玄参30 g，当归15 g，甘草6 g，人参9 g，麦冬9 g，五味子6 g），加入13倍的去离子水，浸泡30 min后，急火煎煮1.5 h，16层纱布过滤，滤出药渣，隔水浓缩至原药材浓度为2.65 g/mL的药液，此时（60 ℃）
药液相对密度为1.21 g/mL。冷却后加无水乙醇，使含醇量达75%，充分搅拌，4 ℃沉淀24 h，虑取上清，水浴浓缩成稠膏。检测pH值7.1～7.2，密封，4 ℃保存备用。使用时加培养液稀释成原药材浓度为133 ?g/mL的使用液，细菌过滤器过滤后使用。
2.2 SD乳鼠原代培养心肌细胞的方法及鉴定
无菌条件下打开新生SD大鼠胸部，取下心脏，剪成大小约1 mm3小块。用0.08%胰蛋白酶与0.1%Ⅱ型胶原酶（等量混匀）于37 ℃电热恒温水浴锅中进行消化，每次消化约5 min后收集细胞。二次差速贴壁1.5 h后，轻轻吸出上悬液，调整细胞密度约1×106个/mL，每毫升培养液中加入0.1 mmol/L的Brdu。24 h后行第1次换液，以后隔日换液1次。α-Actin免疫组化鉴定为心肌细胞[4]。
2.3 SD乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型的建立
缺氧实验开始前，给无糖无血清DMEM/F12培养液充高纯氮气以置换培养液中的氧气，高纯氮气自氮气钢罐中释放出时先经过细菌过滤器接无菌输液管，再充入无糖无血清DMEM/F12培养液中。缺氧实验开始时，弃去原培养液，更换无糖无血清培养液，将细胞培养板放置于自制缺氧盒中。自制缺氧盒有进气口和出气口，先用注射器自出气口尽量抽真空，再自进气口向缺氧盒中继续充高纯氮气30～40 min，置换盒中的氧气，关闭缺氧盒的进气口与出气口，在37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养，缺氧4 h。4 h后，各组更换不同目的培养液，继续在37 ℃、5%CO2培养箱中培养2 h，即为复氧。以模拟心肌细胞缺血再灌注损伤[5]。
2.4 分组与给药
原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为3组。正常组：不进行缺氧/复氧的处理，也不加四妙勇安汤合生脉饮的醇沉药液进行干预；模型组：进行缺氧/复氧的处理，但不加四妙勇安汤合生脉饮的醇沉药液；药物干预组：进行缺氧/复氧的处理，加四妙勇安汤合生脉饮的醇沉药液进行干预。实验开始时正常组更换完全培养基入培养箱培养6 h；模型组、药物干预组更换无糖无血清培养液，缺氧培养4 h，随后模型组更换完全培养基，药物干预组更换含有10%四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液的完全培养基，复氧2 h，根据不同实验目的用于实验。
2.5 MTT比色法检测心肌细胞活力
将心肌细胞接种于96孔板中，每孔200 ?L，细胞密度为3×105/mL。参照上述缺氧/复氧模型的建立及实验分组分别建立96孔板中缺氧模型并进行实验分组。每组均设8个复孔。将MTT配成终浓度为0.5 mg/mL的使用液。缺氧/复氧结束后，弃去96孔板中的培养液，用D-hanks液轻轻地冲洗2次，每孔加入MTT溶液100 ?L，37 ℃、5%CO2培养箱中孵育4 h。取出培养板弃去原MTT，每孔加入DMSO 100 ?L溶解沉淀，微量振荡器振荡15～20 min。在酶标仪上采用波长490 nm检测各孔光密度值（OD）。同时设与实验组平行的空白对照孔，作为空白孔调零，不加细胞只加培养液，其他实验步骤相同。 2.6 流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双染法检测心肌细胞凋亡
将细胞接种于6孔培养板中，每孔2 mL，细胞密度为1×106/mL，参照上述缺氧/复氧模型的建立及实验分组分别建立6孔板中缺氧模型并进行实验分组。每组2孔细胞，即一个样本，重复3次实验。结合AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒的操作，上流式细胞仪检测。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据用—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果（见表1、表2）
5 讨论
近20年，细胞凋亡涉及各个研究领域，已成为科研人员研究的一个热点内容。心肌细胞凋亡参与了缺氧、缺血后再灌注引起的心肌损伤，研究心肌细胞凋亡有可能为临床治疗缺血缺氧性心脏病提供新的思路和方法。
MTT比色法可用于研究心肌细胞的存活力，是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT法的原理是活细胞线粒体含有的琥珀酸脱氢酶能够还原外源性的黄色MTT为不溶于水的紫蓝色沉淀物，这种沉淀物被称之为甲臜（Formazan）并沉积于细胞中，但是死亡细胞则没有此种反应。在一定细胞数范围内，甲臢的形成量与活细胞数量成正比，甲臢形成量能够间接反映细胞的存活力。二甲基亚砜能溶解细胞中的沉淀物甲瓒，在酶标仪上选择波长490 nm处来检测这种物质的光吸收值，从而间接地相对地反映存活状态的心肌细胞的数量，也就能够反应细胞的存活力。本实验结果表明，四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液具有增加缺氧/复氧损伤后心肌细胞存活力的作用。
Annexin V-FITC/PI双染法是流式细胞术中常用的定量检测细胞凋亡的方法之一。本实验采用AnnexinⅤ与PI双染法可以将活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、坏死细胞、损伤细胞区别开来，经流式细胞术检测统计分析得出细胞凋亡率。本实验结果表明，在正常心肌细胞中存在心肌细胞凋亡，在缺氧复氧损伤后，模型组心肌细胞凋亡增多，细胞凋亡率上升，在加入四妙勇安汤合生脉饮后心肌细胞凋亡率下降。由此可以得出，该醇沉药液可以对缺氧/复氧后心肌细胞的凋亡起到保护作用，减少缺氧/复氧后细胞凋亡的数量。实验结果表明，四妙勇安汤合生脉饮对心肌细胞凋亡具有保护作用，但是其机制还有待进一步研究。
参考文献：
[1] 刘真，于慧卿，魏运湘，等.四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响[J].中国中医药信息杂志，2010，17（5）：31-33.
[2] 朱寅圣.四妙勇安汤合生脉饮治疗冠心病120例[J].时珍国医国药， 2007，18（11）：2824.
[3] 张淑芹，范志涛，刘翠文.四妙勇安汤合失笑散治疗急性心肌梗死疗效观察[J].中西医结合心脑血管病杂志，2013，11（5）：535-537.
[4] 张丽娜，金国琴，郭炜，等.原代乳鼠心肌细胞的培养方法[J].中药药理与临床，2010，26（5）：148-150.
[5] Song G， He L， Wang B， et al. Astragalus injection exerts antireperfusion injury through ERK1/2 pathway in cultured cardiac myocytes[J]. Chin J ECC，2008，6（1）：52-54.
（收稿日期：2013-08-12，编辑：华强）
关键词：四妙勇安汤；生脉饮；心肌细胞凋亡；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0035-03
近年来实验研究显示四妙勇安汤具有抗动脉粥样硬化、保护血管新生的作用[1]，部分临床试验表明四妙勇安汤加味对冠心病以及急性心肌梗死患者疗效确切[2-3]。生脉饮临床主要用于冠心病、心肌梗死、心力衰竭及各种休克的治疗。四妙勇安汤合生脉饮是否能够起到保护心肌细胞的作用，是否通过参与细胞凋亡影响心肌细胞活性，相关报道很少。因此，本研究观察四妙勇安汤合生脉饮对心肌细胞凋亡的影响。
1 实验材料
1.1 动物
SD乳鼠，出生24 h以内，SPF级，雌雄不限，购于河北医科大学实验动物中心，动物合格证号：1308037。
1.2 药物
四妙勇安汤合生脉饮药物组成：金银花30 g，玄参30 g，当归15 g，甘草6 g，人参9 g，麦冬9 g，五味子6 g。石家庄
市中医院中药房提供。
1.3 主要试剂与仪器
胰蛋白酶（美国Sigma），DMEM/F12（美国Gibco），Ⅱ型胶原酶（美国Sigma），胎牛血清（奥地利PAA），5-溴脱氧尿嘧啶（Brdu，美国Sigma），α-Actin兔单克隆抗体（美国Epitomics），兔免疫组化试剂盒（北京四正柏），AnnexinⅤ-PI双染试剂盒（MultiSciences）等。311型CO2恒温培养箱（美国Thermo公司），AIRTEC-vs型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），Olympus-IX71倒置相差显微镜（日本OLYMPUS）， Olympus光学显微镜（日本OLYMPUS），流式细胞仪（美国Beckman），低速离心机（北京医用离心机厂）。
2 实验方法
2.1 四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液的制备
按原方准确称取每味中药（金银花30 g，玄参30 g，当归15 g，甘草6 g，人参9 g，麦冬9 g，五味子6 g），加入13倍的去离子水，浸泡30 min后，急火煎煮1.5 h，16层纱布过滤，滤出药渣，隔水浓缩至原药材浓度为2.65 g/mL的药液，此时（60 ℃）
药液相对密度为1.21 g/mL。冷却后加无水乙醇，使含醇量达75%，充分搅拌，4 ℃沉淀24 h，虑取上清，水浴浓缩成稠膏。检测pH值7.1～7.2，密封，4 ℃保存备用。使用时加培养液稀释成原药材浓度为133 ?g/mL的使用液，细菌过滤器过滤后使用。
2.2 SD乳鼠原代培养心肌细胞的方法及鉴定
无菌条件下打开新生SD大鼠胸部，取下心脏，剪成大小约1 mm3小块。用0.08%胰蛋白酶与0.1%Ⅱ型胶原酶（等量混匀）于37 ℃电热恒温水浴锅中进行消化，每次消化约5 min后收集细胞。二次差速贴壁1.5 h后，轻轻吸出上悬液，调整细胞密度约1×106个/mL，每毫升培养液中加入0.1 mmol/L的Brdu。24 h后行第1次换液，以后隔日换液1次。α-Actin免疫组化鉴定为心肌细胞[4]。
2.3 SD乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型的建立
缺氧实验开始前，给无糖无血清DMEM/F12培养液充高纯氮气以置换培养液中的氧气，高纯氮气自氮气钢罐中释放出时先经过细菌过滤器接无菌输液管，再充入无糖无血清DMEM/F12培养液中。缺氧实验开始时，弃去原培养液，更换无糖无血清培养液，将细胞培养板放置于自制缺氧盒中。自制缺氧盒有进气口和出气口，先用注射器自出气口尽量抽真空，再自进气口向缺氧盒中继续充高纯氮气30～40 min，置换盒中的氧气，关闭缺氧盒的进气口与出气口，在37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养，缺氧4 h。4 h后，各组更换不同目的培养液，继续在37 ℃、5%CO2培养箱中培养2 h，即为复氧。以模拟心肌细胞缺血再灌注损伤[5]。
2.4 分组与给药
原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为3组。正常组：不进行缺氧/复氧的处理，也不加四妙勇安汤合生脉饮的醇沉药液进行干预；模型组：进行缺氧/复氧的处理，但不加四妙勇安汤合生脉饮的醇沉药液；药物干预组：进行缺氧/复氧的处理，加四妙勇安汤合生脉饮的醇沉药液进行干预。实验开始时正常组更换完全培养基入培养箱培养6 h；模型组、药物干预组更换无糖无血清培养液，缺氧培养4 h，随后模型组更换完全培养基，药物干预组更换含有10%四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液的完全培养基，复氧2 h，根据不同实验目的用于实验。
2.5 MTT比色法检测心肌细胞活力
将心肌细胞接种于96孔板中，每孔200 ?L，细胞密度为3×105/mL。参照上述缺氧/复氧模型的建立及实验分组分别建立96孔板中缺氧模型并进行实验分组。每组均设8个复孔。将MTT配成终浓度为0.5 mg/mL的使用液。缺氧/复氧结束后，弃去96孔板中的培养液，用D-hanks液轻轻地冲洗2次，每孔加入MTT溶液100 ?L，37 ℃、5%CO2培养箱中孵育4 h。取出培养板弃去原MTT，每孔加入DMSO 100 ?L溶解沉淀，微量振荡器振荡15～20 min。在酶标仪上采用波长490 nm检测各孔光密度值（OD）。同时设与实验组平行的空白对照孔，作为空白孔调零，不加细胞只加培养液，其他实验步骤相同。 2.6 流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双染法检测心肌细胞凋亡
将细胞接种于6孔培养板中，每孔2 mL，细胞密度为1×106/mL，参照上述缺氧/复氧模型的建立及实验分组分别建立6孔板中缺氧模型并进行实验分组。每组2孔细胞，即一个样本，重复3次实验。结合AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒的操作，上流式细胞仪检测。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据用—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果（见表1、表2）
5 讨论
近20年，细胞凋亡涉及各个研究领域，已成为科研人员研究的一个热点内容。心肌细胞凋亡参与了缺氧、缺血后再灌注引起的心肌损伤，研究心肌细胞凋亡有可能为临床治疗缺血缺氧性心脏病提供新的思路和方法。
MTT比色法可用于研究心肌细胞的存活力，是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT法的原理是活细胞线粒体含有的琥珀酸脱氢酶能够还原外源性的黄色MTT为不溶于水的紫蓝色沉淀物，这种沉淀物被称之为甲臜（Formazan）并沉积于细胞中，但是死亡细胞则没有此种反应。在一定细胞数范围内，甲臢的形成量与活细胞数量成正比，甲臢形成量能够间接反映细胞的存活力。二甲基亚砜能溶解细胞中的沉淀物甲瓒，在酶标仪上选择波长490 nm处来检测这种物质的光吸收值，从而间接地相对地反映存活状态的心肌细胞的数量，也就能够反应细胞的存活力。本实验结果表明，四妙勇安汤合生脉饮醇沉药液具有增加缺氧/复氧损伤后心肌细胞存活力的作用。
Annexin V-FITC/PI双染法是流式细胞术中常用的定量检测细胞凋亡的方法之一。本实验采用AnnexinⅤ与PI双染法可以将活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、坏死细胞、损伤细胞区别开来，经流式细胞术检测统计分析得出细胞凋亡率。本实验结果表明，在正常心肌细胞中存在心肌细胞凋亡，在缺氧复氧损伤后，模型组心肌细胞凋亡增多，细胞凋亡率上升，在加入四妙勇安汤合生脉饮后心肌细胞凋亡率下降。由此可以得出，该醇沉药液可以对缺氧/复氧后心肌细胞的凋亡起到保护作用，减少缺氧/复氧后细胞凋亡的数量。实验结果表明，四妙勇安汤合生脉饮对心肌细胞凋亡具有保护作用，但是其机制还有待进一步研究。
参考文献：
[1] 刘真，于慧卿，魏运湘，等.四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响[J].中国中医药信息杂志，2010，17（5）：31-33.
[2] 朱寅圣.四妙勇安汤合生脉饮治疗冠心病120例[J].时珍国医国药， 2007，18（11）：2824.
[3] 张淑芹，范志涛，刘翠文.四妙勇安汤合失笑散治疗急性心肌梗死疗效观察[J].中西医结合心脑血管病杂志，2013，11（5）：535-537.
[4] 张丽娜，金国琴，郭炜，等.原代乳鼠心肌细胞的培养方法[J].中药药理与临床，2010，26（5）：148-150.
[5] Song G， He L， Wang B， et al. Astragalus injection exerts antireperfusion injury through ERK1/2 pathway in cultured cardiac myocytes[J]. Chin J ECC，2008，6（1）：52-54.
（收稿日期：2013-08-12，编辑：华强）