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摘要：本文介绍了一步样品处理气相色谱测定饼干中脂肪酸的新方法，并将其成功应用于实验教学。样品、乙酰氯-甲醇溶液和正己烷（含内标），密封于反应管中80℃水浴条件下反应提取2h，加入碳酸钾溶液中和，静置分层；上清液经毛细管色谱柱，氮气作载气，等压模式色谱分离，火焰离子化检测器进行检测。通过对5个实际样品的测定表明，十二烷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸是饼干样品脂肪酸组成的主体，其中2个样品有反式油酸检出；将本法用于食品仪器分析实验教学具有专业特色鲜明、知识点多、操作简单、实验耗时适中和实验成本低等特点。
关键词：饼干；脂肪酸；气相色谱法；实验教学
中图分类号：G642.4 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）35-0231-03
仪器分析是食品科学学科的一门重要基础课，而其中实验教学是一个重要环节。但是，随着科技的进步，大型分析仪器的信息化和自动化程度不断提高，实验中要求学生动手的份额却随之下降，给如何合理地设计实验、安排实验，如何精选实验内容提出了新的挑战。本文以气相色谱法的实验教学为例，结合教学专业和人们对食品质量、营养与健康的关注，以饼干脂肪酸的测定为实验内容，通过改进样品处理，建立了一个实用的脂肪酸检测方法，同时将其合理地应用于实验教学，并对教学效果进行了讨论。
一、材料与方法
1.材料与试剂。各种饼干样品购自本地超市；分析纯甲醇、甲苯、乙酰氯和碳酸钾（北京化学试剂公司）；正十九碳脂肪酸甲酯、C4-C24三十七种脂肪酸甲酯标准品（Sigma公司）。
2.仪器与设备。Agilent7890A气相色谱仪，配火焰离子化检测器和7693自动进样器（美国，安捷伦公司）；恒温水浴锅（常州翔天实验仪器厂）；2.0×15cm带胶塞和螺口盖玻璃水解管。
3.溶液配制。乙酰氯-甲醇溶液（1+10，v/v）：将10mL乙酰氯甲醇在不断搅拌的条件下缓慢滴入100mL甲醇中，室温贮存于带磨口盖的广口瓶中。内标溶液（1.0mg·mL-1）：准确称取正十九碳脂肪酸甲酯0.5g，用少量正己烷溶解，并转移定容至500.0mL容量瓶中，于贮液瓶中冷冻保存，使用时放置到室温取用。碳酸钾溶液（60g·L-1）：6g碳酸钾溶于水，定容至100.0mL容量瓶中。
4.样品处理。将饼干样品于研钵中研碎，混匀，然后准确称取0.2000-0.4000g于2.0×15cm水解管中，准确加入5.00mL内标溶液和4.00mL乙酰氯-甲醇溶液，充氮气后，塞紧橡皮塞，拧紧螺口盖，于80℃水浴反应2h。取出冷却，加入5.0mL碳酸钾溶液，漩涡震荡使充分混合，静止，待分层后（如分层较慢可离心处理）取上清于进样小瓶中进行气相色谱分析。
5.分析条件。使用J&WDB-23（60m×0.25mm×0.25μm）色谱柱，载气为氮气，程温恒压模式进行分离。柱头压力为33.3psi；进样口温度250℃，分流进样，分流比为30：1；升温程序为：60℃保持1min，20℃/min至150℃保持10min，5℃/min至190℃保持25min，20℃/min至200℃保持20min，10℃/min至220℃保持5min。检测器温度300℃，空气流速400mL/min，氢气流速30mL/min，尾吹气25mL/min。
6.结果计算。公式①：wi=Ai×Fi×（mC19：0/AC19：0）/m。公式②：Xi=Ai×Fi×（mC19：0/AC19：0）/∑（Ai×Fi×mC19：0/AC19：0）×100%。式中：wi为各脂肪酸含量（近似用脂肪酸甲酯含量表示），mg·g-1；Ai为各脂肪酸的色谱峰面积；Fi为各脂肪酸的理论相对校正因子；mC19：0为内标质量，g；AC19：0为内标色谱峰峰面积；m为样品质量，g；Xi为各脂肪酸百分组成。
二、结果与讨论
1.对样品处理方法的改进。食品中脂肪酸的测定一般需经过提脂、皂化和甲酯化等过程[1]，实验用时长，不能满足教学实验的要求。一步提取法是指在样品反应管中同时加入甲酯化试剂和提取剂，反应后生成的脂肪酸甲酯既被有效提取到有机试剂中，操作较为方便。关于一步法的可靠性已有充分的论证[2-4]且被新国标方法[5]所采纳。本实验不同之处在于提取溶剂中定量加入了内标物。由于处理过程等同采用国标方法[5]，保证了实验结果的可靠性；又因内标的使用从而提高了定量分析的准确性。
2.色谱分离与定量分析。脂肪酸（甲酯）的色谱分离，常用固定相有键合聚乙二醇和键合氢氰丙基芳基聚硅氧烷，毛细管柱长根据脂肪酸组成情况可选择30m、60m或100m。本实验使用60m长的键合氢氰丙基芳基聚硅氧烷毛细管柱，通过优化升温程序，在1.5的优化条件下，完成对38种脂肪酸甲酯（含内标）的有效分离，特别是C18：1n9t与C18：1n9c，C18：2n6t与C18：2n6c达到了完全分离，与文献[5]中使用100m长毛细管柱的分离效果相当（色谱图略），样品基质对各脂肪酸的分离无干扰。本实验中，脂肪酸含量和组成的定量，分别使用内标法和归一化法进行（见公式①和②）。只要对色谱图中各脂肪酸的色谱峰进行正确识别后，根据内标质量、样品质量和理论相对校正因子，就可实现对脂肪酸的准确定量，从而节省了实验成本。其中理论相对校正因子可根据火焰离子化检测器响应与组分有效碳数成正比的特点[6]，进行计算，本文不在赘述。
3.实际样品的测定。应用本方法对市场采集的5个饼干样品进行了测定，结果见表1，含量大于1mg/g的脂肪酸组分其最大偏差仅为3.09%，十二烷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸是饼干样品脂肪酸组成的主体，芝士注心饼干有反式油酸（C18：1n9t0）出，含量高达55.2mg/g。脂肪酸组成可依据表1，根据公式②进行计算，本文不在列出。 4.实验教学效果分析。本实验根据教学专业，结合人们对食品质量、营养与健康的关注，进行选题。油脂的摄入量及其脂肪酸组成与肥胖、高血脂症、糖尿病及心血管疾病等关系密切[7-8]；饼干类糕点又是大学生喜爱的食品之一，因此该实验的选题即不失专业特色，又有效地提高了学生的实验和学习兴趣。其次，本实验涉覆盖的知识点多。从样品处理到完成数据分析，覆盖了色谱教学的主要知识点，对课堂教学知识起到很好的深化作用。再次，有利于安排实验。由于样品处理相对简单，又有较长等待时间，正好为学生了解仪器和学习操作软件的使用提供了时机；同时不占用课上时间，这样有效地提高了实验教学效率。
本文建立了一步样品处理气相色谱法测定饼干脂肪酸的新方法，并将其成功应用与实验教学。结果表明本方法实用、高效，同时收到了较好的实验教学效果，为食品科学专业仪器分析实验教学或小学期实验教学提供了一个优质的实验题材。
参考文献：
[1]中华人民共和国卫生部/中国国家标准化管理委员会.GB/T9695.2-2008肉与肉制品脂肪酸测定[S].北京：中国标准出版社，2008.
[2]SUKHIJA P S，PALMQUIST D L.Rapid method for determination of totao fatty acid content and composition of feedstuffs and faces [J].J Agric.Food Chem，1988，36（6）：1202-1206.
[3]MEIER S，MJOS S A，JOENSEN H，GRAHL-NIELSEN O.Validation of a one-step extraction/methylation method for determination of fatty acids and cholesterol in marine tissues[J].Journal of Chromatography A，2006，1104：291–298.
[4]黄菲菲，赵嘉胤，王建军，陈景春.一步提取测定食品中的脂肪酸[J].食品工业科技，2012，33（2）：77-79.
[5]中华人民共和国卫生部.GB 5413.27-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2010.
[6]张丽英.高级饲料分析技术[M].北京：中国农业大学出版社，2011.
[7]张飞，柏云爱，鲁海龙.饱和脂肪酸与健康研究进展[J].中国油脂，2012，37（4）：29-32.
[8]PRENTKI M，MURTHY MADIRAJU S R.Glycerolipid/free fatty acid cycle and isletβ-cell function in health，obesity and diabetes[J].Molecular and Cellular Endocrinology，2012，353（1–2）：88-100.
基金项目：北京农学院基础科学基金项目（2067516001）；北京市教委项目（KM201310020009）
作者简介：王宗义，男，博士，讲师，从事食品质量安全检测教学与科研。
关键词：饼干；脂肪酸；气相色谱法；实验教学
中图分类号：G642.4 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）35-0231-03
仪器分析是食品科学学科的一门重要基础课，而其中实验教学是一个重要环节。但是，随着科技的进步，大型分析仪器的信息化和自动化程度不断提高，实验中要求学生动手的份额却随之下降，给如何合理地设计实验、安排实验，如何精选实验内容提出了新的挑战。本文以气相色谱法的实验教学为例，结合教学专业和人们对食品质量、营养与健康的关注，以饼干脂肪酸的测定为实验内容，通过改进样品处理，建立了一个实用的脂肪酸检测方法，同时将其合理地应用于实验教学，并对教学效果进行了讨论。
一、材料与方法
1.材料与试剂。各种饼干样品购自本地超市；分析纯甲醇、甲苯、乙酰氯和碳酸钾（北京化学试剂公司）；正十九碳脂肪酸甲酯、C4-C24三十七种脂肪酸甲酯标准品（Sigma公司）。
2.仪器与设备。Agilent7890A气相色谱仪，配火焰离子化检测器和7693自动进样器（美国，安捷伦公司）；恒温水浴锅（常州翔天实验仪器厂）；2.0×15cm带胶塞和螺口盖玻璃水解管。
3.溶液配制。乙酰氯-甲醇溶液（1+10，v/v）：将10mL乙酰氯甲醇在不断搅拌的条件下缓慢滴入100mL甲醇中，室温贮存于带磨口盖的广口瓶中。内标溶液（1.0mg·mL-1）：准确称取正十九碳脂肪酸甲酯0.5g，用少量正己烷溶解，并转移定容至500.0mL容量瓶中，于贮液瓶中冷冻保存，使用时放置到室温取用。碳酸钾溶液（60g·L-1）：6g碳酸钾溶于水，定容至100.0mL容量瓶中。
4.样品处理。将饼干样品于研钵中研碎，混匀，然后准确称取0.2000-0.4000g于2.0×15cm水解管中，准确加入5.00mL内标溶液和4.00mL乙酰氯-甲醇溶液，充氮气后，塞紧橡皮塞，拧紧螺口盖，于80℃水浴反应2h。取出冷却，加入5.0mL碳酸钾溶液，漩涡震荡使充分混合，静止，待分层后（如分层较慢可离心处理）取上清于进样小瓶中进行气相色谱分析。
5.分析条件。使用J&WDB-23（60m×0.25mm×0.25μm）色谱柱，载气为氮气，程温恒压模式进行分离。柱头压力为33.3psi；进样口温度250℃，分流进样，分流比为30：1；升温程序为：60℃保持1min，20℃/min至150℃保持10min，5℃/min至190℃保持25min，20℃/min至200℃保持20min，10℃/min至220℃保持5min。检测器温度300℃，空气流速400mL/min，氢气流速30mL/min，尾吹气25mL/min。
6.结果计算。公式①：wi=Ai×Fi×（mC19：0/AC19：0）/m。公式②：Xi=Ai×Fi×（mC19：0/AC19：0）/∑（Ai×Fi×mC19：0/AC19：0）×100%。式中：wi为各脂肪酸含量（近似用脂肪酸甲酯含量表示），mg·g-1；Ai为各脂肪酸的色谱峰面积；Fi为各脂肪酸的理论相对校正因子；mC19：0为内标质量，g；AC19：0为内标色谱峰峰面积；m为样品质量，g；Xi为各脂肪酸百分组成。
二、结果与讨论
1.对样品处理方法的改进。食品中脂肪酸的测定一般需经过提脂、皂化和甲酯化等过程[1]，实验用时长，不能满足教学实验的要求。一步提取法是指在样品反应管中同时加入甲酯化试剂和提取剂，反应后生成的脂肪酸甲酯既被有效提取到有机试剂中，操作较为方便。关于一步法的可靠性已有充分的论证[2-4]且被新国标方法[5]所采纳。本实验不同之处在于提取溶剂中定量加入了内标物。由于处理过程等同采用国标方法[5]，保证了实验结果的可靠性；又因内标的使用从而提高了定量分析的准确性。
2.色谱分离与定量分析。脂肪酸（甲酯）的色谱分离，常用固定相有键合聚乙二醇和键合氢氰丙基芳基聚硅氧烷，毛细管柱长根据脂肪酸组成情况可选择30m、60m或100m。本实验使用60m长的键合氢氰丙基芳基聚硅氧烷毛细管柱，通过优化升温程序，在1.5的优化条件下，完成对38种脂肪酸甲酯（含内标）的有效分离，特别是C18：1n9t与C18：1n9c，C18：2n6t与C18：2n6c达到了完全分离，与文献[5]中使用100m长毛细管柱的分离效果相当（色谱图略），样品基质对各脂肪酸的分离无干扰。本实验中，脂肪酸含量和组成的定量，分别使用内标法和归一化法进行（见公式①和②）。只要对色谱图中各脂肪酸的色谱峰进行正确识别后，根据内标质量、样品质量和理论相对校正因子，就可实现对脂肪酸的准确定量，从而节省了实验成本。其中理论相对校正因子可根据火焰离子化检测器响应与组分有效碳数成正比的特点[6]，进行计算，本文不在赘述。
3.实际样品的测定。应用本方法对市场采集的5个饼干样品进行了测定，结果见表1，含量大于1mg/g的脂肪酸组分其最大偏差仅为3.09%，十二烷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸是饼干样品脂肪酸组成的主体，芝士注心饼干有反式油酸（C18：1n9t0）出，含量高达55.2mg/g。脂肪酸组成可依据表1，根据公式②进行计算，本文不在列出。 4.实验教学效果分析。本实验根据教学专业，结合人们对食品质量、营养与健康的关注，进行选题。油脂的摄入量及其脂肪酸组成与肥胖、高血脂症、糖尿病及心血管疾病等关系密切[7-8]；饼干类糕点又是大学生喜爱的食品之一，因此该实验的选题即不失专业特色，又有效地提高了学生的实验和学习兴趣。其次，本实验涉覆盖的知识点多。从样品处理到完成数据分析，覆盖了色谱教学的主要知识点，对课堂教学知识起到很好的深化作用。再次，有利于安排实验。由于样品处理相对简单，又有较长等待时间，正好为学生了解仪器和学习操作软件的使用提供了时机；同时不占用课上时间，这样有效地提高了实验教学效率。
本文建立了一步样品处理气相色谱法测定饼干脂肪酸的新方法，并将其成功应用与实验教学。结果表明本方法实用、高效，同时收到了较好的实验教学效果，为食品科学专业仪器分析实验教学或小学期实验教学提供了一个优质的实验题材。
参考文献：
[1]中华人民共和国卫生部/中国国家标准化管理委员会.GB/T9695.2-2008肉与肉制品脂肪酸测定[S].北京：中国标准出版社，2008.
[2]SUKHIJA P S，PALMQUIST D L.Rapid method for determination of totao fatty acid content and composition of feedstuffs and faces [J].J Agric.Food Chem，1988，36（6）：1202-1206.
[3]MEIER S，MJOS S A，JOENSEN H，GRAHL-NIELSEN O.Validation of a one-step extraction/methylation method for determination of fatty acids and cholesterol in marine tissues[J].Journal of Chromatography A，2006，1104：291–298.
[4]黄菲菲，赵嘉胤，王建军，陈景春.一步提取测定食品中的脂肪酸[J].食品工业科技，2012，33（2）：77-79.
[5]中华人民共和国卫生部.GB 5413.27-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2010.
[6]张丽英.高级饲料分析技术[M].北京：中国农业大学出版社，2011.
[7]张飞，柏云爱，鲁海龙.饱和脂肪酸与健康研究进展[J].中国油脂，2012，37（4）：29-32.
[8]PRENTKI M，MURTHY MADIRAJU S R.Glycerolipid/free fatty acid cycle and isletβ-cell function in health，obesity and diabetes[J].Molecular and Cellular Endocrinology，2012，353（1–2）：88-100.
基金项目：北京农学院基础科学基金项目（2067516001）；北京市教委项目（KM201310020009）
作者简介：王宗义，男，博士，讲师，从事食品质量安全检测教学与科研。