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【摘 要】超氧化物歧化酶SOD是一类重要的氧自由基清除剂, 具有抗炎、抗衰老和抗辐射的作用, 作为一类新型的治疗酶制剂已广泛应用在医疗、保健、食品等方面。本文总结近年来常用的三种微生物发酵生产SOD的方法，并对产酶工艺条件进行比较，提出展望。
【关键词】超氧化物歧化酶（SOD）；微生物发酵；工艺条件
【Abstract】Superoxide Dismutase(SOD) is a category of important oxygen free radical scavenger, which has anti-inflammatory, anti-aging and anti-radiation effects. As a new class of therapeutic enzyme,SOD has been widely used in the fields of medicine, health,food and so on. The summarization of the commom-used microbial fementation production of SOD in the recent years and the comparison of three process conditions of enzyme prodution gives us a prospect to a better use of SOD in the future.
【Key words】SOD；Microbial fermentation；Process conditions
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD，EC 1.15.1.1）是一类广泛存在于动物、植物和微生物等多种生物体内的金属酶，与铜（Cu）、锌（Zn）、铁（Fe）、锰（Mn）等金属元素结合[1]。SOD以自由基O2-为底物，催化自由基O2-与H+反应生成H2O2和O2，H2O2在过氧化氢酶、过氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶等作用下转变为H2O，在机体内形成一套解毒系统，从而对机体起防护作用[2]。SOD是一类重要的氧自由基清除酶，具有抗炎、抗衰老和抗辐射的作用，作为一类新型的治疗酶制剂已受到广泛重视和应用[3]。用于制备提取SOD的常用的三种微生物是酵母菌、大肠杆菌和芽孢杆菌。本文总结近年来这三种微生物发酵生产SOD的方法，并对产酶工艺条件进行比较，提出展望。
1.酵母菌发酵生产SOD
廖湘萍等人[4]利用异丙醇破壁、丙酮二次纯化提取SOD生产工艺， 最佳提取条件为: 异丙醇浓度为90%、时间120min、pH7.0，粗酶液的收率为73%，所得SOD的酶比活为3048.7U/mg。
周建琴[5]选用25株酵母菌进行发酵生产SOD的筛选,得到1株高产SOD菌株,并通过单因素试验确定其适宜的培养基组成、pH 值、发酵时间等工艺条件。结果表明，最适宜的碳源为麦芽糖，氮源为蛋白胨，碳氮比为6：1，发酵时间为18h，pH值为5.0。
2.大肠杆菌发酵生产SOD
胡滨等人[6]用90%异丙醇浸泡大肠杆菌菌体，搅拌抽提，离心分离，取上清液（粗酶液）提取SOD，纯化后用连苯三酚法测定酶活力，结果表明，所选的七个因素对SOD产量的影响依次为：摇床转速＞培养时间＞ZnSO4＞FeSO4＞MnSO4＞CuSO4＞培养温度。最佳工艺条件分别为：摇床转速200r/min，以保证充足的氧气供应，但过量的氧对产量影响不大，培养时间14h，此时菌体产量达到最大，SOD含量最高，ZnSO4、MnSO4、FeSO4、CuSO4的加入量分别为50μmol/L、50μmol/L、30μmol/L、30μmol/L，其中CuSO4 加入量處于边缘水平，但因其在七个因素中对单位质量湿菌体产酶量影响较小，故可兼顾其他因素而做调整，培养温度38℃，在七个因素中对单位质量湿菌体产酶量的影响程度最小，产酶量达7726IU/g 湿菌体。
3.芽孢杆菌发酵生产SOD
张军霞等人[7]用异丙醇浸泡枯草芽孢杆菌菌体，抽滤搅拌，高速冷冻离心，制备SOD粗酶原液，选用热变、等电点沉淀、硫酸铵分级盐析等方法处理粗酶液，用邻苯三酚自氧化法测定酶活力，结果表明，硫酸铵分级盐析法纯化操作简单，条件温和，提纯效果显著，处理后酶液的酶活力可达688U/mL。
4.展望
美国和日本先后开发了用发酵法生产SOD，但由于SOD为胞内酶，发酵法提取纯化工艺极为复杂，至少需要6步，一般经过细胞破碎、离心、盐析、透析、离子交换层析(2～3 次)和凝胶层析等才能达到比活＞3000U/mg。SOD收率只有30%左右。Grunow开发的冻融法破碎细胞及疏水色谱纯化工艺，将分离工艺简化到5步，SOD收率达到68%，但冻融法破碎细胞及疏水色谱都很难放大[8]。
综上所述，超氧化物歧化酶需氧量是优先控制的工艺条件，而该酶耐温性较佳，因此，培养温度是最次要的工艺条件。进行细胞破碎操作时，可以选用高浓度异丙醇，效果较为理想。进行纯化操作时，选择常规的硫酸铵分级盐析法，更利于提高分离效率。若应用基因工程等手段，使超氧化物歧化酶的基因能在微生物体内表达，就可以选育高产菌株，节约目前使用动物血生产SOD的经济成本，加快生产周期，提高生产效率。
【参考文献】
［１］李敬玺，王选年，银梅，等.超氧化物歧化酶（SOD）的研究、应用和展望[A].中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十五次、中国病理生理学会动物病生专业委员会第十四次学术讨论会论文集[C]，2007.
［２］杜开书，柴立英.郎剑锋意大利蜜蜂蛹超氧化物歧化酶提取技术研究[J].安徽农业科学，2006（23）.
［３］迟乃玉，张庆芳，刘长江.SOD的化学特性及其应用[J].沈阳农业大学学报，1999-04，3（2）：171-175.
［４］廖湘萍，徐功瑾，付三乔.利用啤酒酵母生产SOD的提取条件研究[J].酿酒科技，2007.
［５］周建琴.酵母SOD 高产菌的选育及发酵条件的研究[J].安徽农业科学，2008（36）31：13494-13495，13554.
［６］胡滨，赵艳丽，吴兆亮.大肠杆菌发酵生产SOD最佳条件研究[J].生物技术，2002，12（3）.
［７］张军霞，仲平，李兰.从枯草芽孢杆菌中提纯SOD的几种方法比较[J].生命科学仪器，2009（7）.
［８］王素芳，蒋琳兰，赵树进. 微生物超氧化物歧化酶的研究进展[J].药物生物技术，2002，9（6）：378-380.
【关键词】超氧化物歧化酶（SOD）；微生物发酵；工艺条件
【Abstract】Superoxide Dismutase(SOD) is a category of important oxygen free radical scavenger, which has anti-inflammatory, anti-aging and anti-radiation effects. As a new class of therapeutic enzyme,SOD has been widely used in the fields of medicine, health,food and so on. The summarization of the commom-used microbial fementation production of SOD in the recent years and the comparison of three process conditions of enzyme prodution gives us a prospect to a better use of SOD in the future.
【Key words】SOD；Microbial fermentation；Process conditions
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD，EC 1.15.1.1）是一类广泛存在于动物、植物和微生物等多种生物体内的金属酶，与铜（Cu）、锌（Zn）、铁（Fe）、锰（Mn）等金属元素结合[1]。SOD以自由基O2-为底物，催化自由基O2-与H+反应生成H2O2和O2，H2O2在过氧化氢酶、过氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶等作用下转变为H2O，在机体内形成一套解毒系统，从而对机体起防护作用[2]。SOD是一类重要的氧自由基清除酶，具有抗炎、抗衰老和抗辐射的作用，作为一类新型的治疗酶制剂已受到广泛重视和应用[3]。用于制备提取SOD的常用的三种微生物是酵母菌、大肠杆菌和芽孢杆菌。本文总结近年来这三种微生物发酵生产SOD的方法，并对产酶工艺条件进行比较，提出展望。
1.酵母菌发酵生产SOD
廖湘萍等人[4]利用异丙醇破壁、丙酮二次纯化提取SOD生产工艺， 最佳提取条件为: 异丙醇浓度为90%、时间120min、pH7.0，粗酶液的收率为73%，所得SOD的酶比活为3048.7U/mg。
周建琴[5]选用25株酵母菌进行发酵生产SOD的筛选,得到1株高产SOD菌株,并通过单因素试验确定其适宜的培养基组成、pH 值、发酵时间等工艺条件。结果表明，最适宜的碳源为麦芽糖，氮源为蛋白胨，碳氮比为6：1，发酵时间为18h，pH值为5.0。
2.大肠杆菌发酵生产SOD
胡滨等人[6]用90%异丙醇浸泡大肠杆菌菌体，搅拌抽提，离心分离，取上清液（粗酶液）提取SOD，纯化后用连苯三酚法测定酶活力，结果表明，所选的七个因素对SOD产量的影响依次为：摇床转速＞培养时间＞ZnSO4＞FeSO4＞MnSO4＞CuSO4＞培养温度。最佳工艺条件分别为：摇床转速200r/min，以保证充足的氧气供应，但过量的氧对产量影响不大，培养时间14h，此时菌体产量达到最大，SOD含量最高，ZnSO4、MnSO4、FeSO4、CuSO4的加入量分别为50μmol/L、50μmol/L、30μmol/L、30μmol/L，其中CuSO4 加入量處于边缘水平，但因其在七个因素中对单位质量湿菌体产酶量影响较小，故可兼顾其他因素而做调整，培养温度38℃，在七个因素中对单位质量湿菌体产酶量的影响程度最小，产酶量达7726IU/g 湿菌体。
3.芽孢杆菌发酵生产SOD
张军霞等人[7]用异丙醇浸泡枯草芽孢杆菌菌体，抽滤搅拌，高速冷冻离心，制备SOD粗酶原液，选用热变、等电点沉淀、硫酸铵分级盐析等方法处理粗酶液，用邻苯三酚自氧化法测定酶活力，结果表明，硫酸铵分级盐析法纯化操作简单，条件温和，提纯效果显著，处理后酶液的酶活力可达688U/mL。
4.展望
美国和日本先后开发了用发酵法生产SOD，但由于SOD为胞内酶，发酵法提取纯化工艺极为复杂，至少需要6步，一般经过细胞破碎、离心、盐析、透析、离子交换层析(2～3 次)和凝胶层析等才能达到比活＞3000U/mg。SOD收率只有30%左右。Grunow开发的冻融法破碎细胞及疏水色谱纯化工艺，将分离工艺简化到5步，SOD收率达到68%，但冻融法破碎细胞及疏水色谱都很难放大[8]。
综上所述，超氧化物歧化酶需氧量是优先控制的工艺条件，而该酶耐温性较佳，因此，培养温度是最次要的工艺条件。进行细胞破碎操作时，可以选用高浓度异丙醇，效果较为理想。进行纯化操作时，选择常规的硫酸铵分级盐析法，更利于提高分离效率。若应用基因工程等手段，使超氧化物歧化酶的基因能在微生物体内表达，就可以选育高产菌株，节约目前使用动物血生产SOD的经济成本，加快生产周期，提高生产效率。
【参考文献】
［１］李敬玺，王选年，银梅，等.超氧化物歧化酶（SOD）的研究、应用和展望[A].中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十五次、中国病理生理学会动物病生专业委员会第十四次学术讨论会论文集[C]，2007.
［２］杜开书，柴立英.郎剑锋意大利蜜蜂蛹超氧化物歧化酶提取技术研究[J].安徽农业科学，2006（23）.
［３］迟乃玉，张庆芳，刘长江.SOD的化学特性及其应用[J].沈阳农业大学学报，1999-04，3（2）：171-175.
［４］廖湘萍，徐功瑾，付三乔.利用啤酒酵母生产SOD的提取条件研究[J].酿酒科技，2007.
［５］周建琴.酵母SOD 高产菌的选育及发酵条件的研究[J].安徽农业科学，2008（36）31：13494-13495，13554.
［６］胡滨，赵艳丽，吴兆亮.大肠杆菌发酵生产SOD最佳条件研究[J].生物技术，2002，12（3）.
［７］张军霞，仲平，李兰.从枯草芽孢杆菌中提纯SOD的几种方法比较[J].生命科学仪器，2009（7）.
［８］王素芳，蒋琳兰，赵树进. 微生物超氧化物歧化酶的研究进展[J].药物生物技术，2002，9（6）：378-380.