【摘 要】
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本研究通过将重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2转化至E.coli BL21感受态细胞中,接种到LB液体培养内,37℃摇菌至OD600为0.6,加入终浓度1 mM IPTG诱导过夜.离心收集细胞沉淀,加入TN
【机 构】
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延边大学农学院动物医学系,吉林 延吉,133002
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会
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本研究通过将重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2转化至E.coli BL21感受态细胞中,接种到LB液体培养内,37℃摇菌至OD600为0.6,加入终浓度1 mM IPTG诱导过夜.离心收集细胞沉淀,加入TNE缓冲液,使菌体悬起.加入溶菌酶,4℃旋转过夜.冰上超声,离心收集上清.按照GST纯化柱纯化NcGRA2蛋白.给健康的BALB/c鼠腹腔注射新孢子虫NcGRA2抗原,共免疫3次,制备抗新孢子虫NcGRA2鼠血清,用Western blotting检测抗体特异性.用免疫荧光实验检测NcGRA2蛋白在新孢子虫细胞内和细胞外的定位.为分析NcGRA2t在新孢子虫在侵入细胞后的定位,感染新孢子虫的Vero细胞培养在盖玻片上,PBS洗一次,用多聚甲醛固定细胞,用0.3％Triton-100孵育5 min增加细胞膜的渗透性.用抗NcGRA2鼠血清孵育后,PBS洗3次.用1：500稀释的Alexa Fluor 488标记的羊抗鼠IgG孵育后,PBS洗3次,用共聚焦显微镜观察荧光信号.为分析NcGRA2在新孢子虫侵入细胞前的定位,纯化后活的新孢子虫速殖子加到12孔载玻片上,如上所述,用多聚甲醛固定后,再分别和一抗、二抗孵育,用共聚焦显微镜观察荧光信号.结果表明,NcGRA2蛋白在新孢子虫侵入细胞前和侵入细胞后均定位在新孢子虫细胞质中.
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