pEGFP-C1-CAR真核表达载体的构建及在原代培养的乳鼠心肌细胞的表达

来源 :中华医学会第十五次全国心血管病学大会 | 被引量 : 0次 | 上传用户:huzhaohua1
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目的:克隆C57BL/6鼠CAR基因,与pEGFP-C1质粒载体连接,转染原代培养的C57BL/6乳鼠心肌细胞,检测CAR的表达.方法:查找CAR基因序列,根据CAR基因开放阅读框架设计合适引物.提取C57BL/6胎鼠心脏总RNA,逆转录合成cDNA,利用引物5′-CCTCTAGACCCAGCCGAGATCGTTT-3′和5′-CCGTCGACAAGAAACGAGCCACGGAC-3′扩增CAR基因,通过XbaI和SalI酶切后纯化,与pBluescriptⅡKS+载体连接,进行转化、蓝白筛选及测序鉴定,构建pBlue-CAR 载体.从所得载体上利用引物5-GGCTCGAGGTatggcgcgcctactgtgc-3‘和5‘-CCGAATTCTATACTATAGACCCGTC-3‘扩增CAR基因,通过XhoI和EcoRI酶切后纯化连接至pEGFP-C1载体,构建重组质粒pEGFP-CI-CAR,经PstI酶切线性化后进行测序鉴定。实验设置2个处理组,经测序鉴定正确的阳性克隆采用LipofectamineHP转染原代培养的C57BL/6乳鼠心肌细胞作为pEGFP-CI-CAR载体转染组,以pEGFP-C1空载体转染心肌细胞作为对照组,分别在于转染后12h,24h,48h,72h,采用RT-qPCR及Western-Blot鉴定其在心肌细胞的表达,倒置荧光显微镜观察EGFP的表达,计算转染效率。结果:得到pEGFP-CI-CAR基因序列。倒置荧光显微镜观察发现转染后24h乳鼠心肌细胞表达EGFP,转染效率达20%。RT-qPCR及Western-Blot示小鼠心肌细胞pEGFP-C1-CAR载体转染后24h CAR表达明显升高。结论:成功克隆C57BL/6鼠CAR基因并构建pEGFP-C:1-CAR真核表达载体,且在小鼠心肌细胞的表达获得成功,为进一步研究CAR在病毒性心肌炎发病机制中的作用奠定了基础。
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