【摘 要】
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目的:（1）建立基于实时荧光环介导等温扩增的人乳头瘤病毒58型（human papillomavirus 58,HPV58）基因检测体系,用于其快速检测和早期诊断。（2）利用环介导等温扩增技术的等温优势与侧向流动试纸条技术的简便性相结合,建立一种用于HPV16、HPV58的快速目视检测方法。方法:（1）运用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplificati
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31460236）
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目的:（1）建立基于实时荧光环介导等温扩增的人乳头瘤病毒58型（human papillomavirus 58,HPV58）基因检测体系,用于其快速检测和早期诊断。（2）利用环介导等温扩增技术的等温优势与侧向流动试纸条技术的简便性相结合,建立一种用于HPV16、HPV58的快速目视检测方法。方法:（1）运用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）在线引物设计软件Primer Explorer V5,针对人乳头瘤病毒58型的L1基因保守区域设计引物,在反应前加入荧光核酸染料SYBR GreenⅠ,并对该反应体系中的d NTPs、Mg SO4和引物浓度进行优化,优化结果通过"S"型扩增曲线判断,并对优化后的实时荧光环介导等温扩增体系进行特异性、灵敏度检测及临床标本检测。（2）运用LAMP在线引物设计软件,针对HPV16的E6基因保守区域及HPV58L1基因的保守区域设计引物及探针。采用生物素标记环引物,荧光基团FAM和淬灭基团BHQ-1标记探针,侧向流动试纸条用于扩增产物可视化检测,从而建立HPV16、HPV58的LAMP-LFD检测方法,分别对反应体系的特异性、灵敏度和临床实用性进行了验证,将LAMP-LFD检测临床DNA样本的结果与实时荧光LAMP扩增及临床实验室检测（q PCR法）得到的结果进行比较。结果:（1）针对人乳头瘤病毒58型基因所建立的实时荧光环介导等温扩增检测体系具有良好的特异性及灵敏度,且与临床实验室检测结果（q PCR方法）的符合率达100%,该检测方法的灵敏度可达10拷贝/μL。（2）成功构建了LAMP-LFD反应体系,对体系优化后的最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为50 min。LFD的检测仅需5 min,故完成检测耗时仅55 min;建立的LAMP-LFD能特异性检出HPV16、HPV58,对其他几种常见高危型HPV呈阴性反应;该方法针对HPV16和HPV58的检测灵敏度均为100拷贝/μL,对50份临床样本的检测结果与实时荧光LAMP和临床实验室检测的符合率达100%。结论:（1）本研究建立了人乳头瘤病毒58型基因的实时荧光环介导等温扩增检测体系,它是一种耗时少、操作简便、特异性强、灵敏度高的方法,适用于HPV临床样本的快速检测及早期筛查。（2）同时,构建了HPV16、HPV58的LAMP-LFD检测体系,该方法是一种快速、简便的目视检测方法。对仪器设备要求低,仅需恒温孵育器即可完成,且检测结果易观察,适用于现场检测及资源匮乏地区的HPV筛查。
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