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外显子连接复合体(exon j unction complex,EJC)位于核质中,参与内含子的剪接过程,在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。本研究以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)作为实验材料,其属于十字花科芸薹属,为我国北方重要的观赏和食用植物。柱头作为花粉接受的场所,其生长发育对植物是否能够繁殖起到了极其重要的作用。为了进一步探讨EJC及其核心外围互作蛋白在参与调控柱头发育过程中的作用机制,我们分离了羽衣甘蓝柱头中EJC核心蛋白基因Mago,eIF4AⅢ和UAP56,及EJC外围蛋白基因GRP、CP29A;利用原核表达纯化技术得到了这些基因的蛋白,并且制备了其多克隆抗体。通过实时定量PCR分析BoMago、BoeIF4AⅢ、BoUAP56基因在柱头发育过程中的表达量情况;通过免疫印迹的方法检测BoMago、BoeIF4AⅢ、BoUAP56蛋白在柱头发育各时期的表达情况;最后通过酵母双杂交实验分析蛋白质间的相互作用。主要获得的研究结果如下:(1)羽衣甘蓝BoMago开放读码框长447 bp,编码148个氨基酸;BoeIF4AⅢ开放读码框长1227 bp,编码408个氨基酸;Bo UAP56开放读码框长1284 bp,编码427个氨基酸;BoGRP1A开放读码框长504 bp,编码167个氨基酸;BoGRP2A开放读码框长510 bp,编码169个氨基酸;BoCP29A开放读码框长975 bp,编码324个氨基酸。(2)羽衣甘蓝BoMago与油菜BnMago和芜菁BrMago同源性均高达99%。BoeIF4AⅢ与BneIF4AⅢ和BreIF4AⅢ氨基酸序列同源性均达到99%。BoUAP56与BnUAP56氨基酸序列同源性能够达到95%;与BrUAP56氨基酸序列同源性也达到97%。BoGRP1A与BnGRP1A 和 BrGRP1A 同源性均高达 99%。BoGRP2A 与 BnGRP2A 和 BrGRP2A 同源性均高达95%。BoCP29A与BnCP29A同源性能够达到99%;与BrCP29A氨基酸序列同源性也达到96%。(3)构建的pET-14b原核表达载体,转化到BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG诱导,蛋白质SDS-PAGE检测诱导表达情况,通过亲和层析纯化蛋白,纯化后获得重组蛋白。蛋白质聚丙烯凝胶显示,BoMago、BoGRP1A、BoGRP2A蛋白大小在17 kDa左右;BoCP29A蛋白大小在38 kDa左右;BoeIF4AⅢ蛋白大小在44 kDa左右;BoUAP56蛋白大小在47 kDa左右。纯化透析后的重组蛋白,免疫小鼠获得多克隆抗体。(4)羽衣甘蓝BoMago基因在柱头发育S1时期具有较高表达量,相比于S5时期增加了约3.9倍,S5时期表达量非常低。BoeIF4AⅢ基因表达量随着柱头的发育成熟其含量不断下降,在S1时期表达量最高约为S5时期的3倍,S5时期表达量最低。BoUAP56在S1时期具有较高表达量,S5时期相比于S1时期下降了约4倍。(5)在羽衣甘蓝柱头发育S1-S5时期中,随着柱头逐渐成熟BoMago、BoeIF4AⅢ和BoUAP56蛋白的表达量均呈现下降趋势,发现这三种蛋白均在柱头发育早期阶段S1时期具有最高的表达量,S5时期表达量达到最低。这表明它们在柱头发育的早期阶段起作用。(6)亚克隆构建 AD-BoMago、AD-BoGRP1A、AD-BoGRP2A、AD-BoCP29A,BD-BoeIF4AⅢ和BD-BoUAP56载体。在酵母双杂交实验中,BoMago与BoeIF4AⅢ存在相互作用,BoeIF4AⅢ与 BoGRP1A 存在相互作用。BoeIF4AⅢ与 BoUAP56、BoCP29A不存在相互作用。BoUAP56与BoGRP1A存在相互作用,BoUAP56与BoCP29A存在相互作用。BoUAP56与BoMago、BoeIF4AⅢ、BoGRP2A不存在相互作用。