细叶百合转录组分析及LpPEX5、LpPEX7基因功能的初步探究

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:guhong_2
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近年来,土壤盐碱化越来越严重,仅本国的盐碱地面积就有9913万公顷。在东北的盐碱土壤中,只有少数几种百合可以生长,细叶百合就是其中之一。PEX家族的基因是植物中参与过氧化物酶体合成的重要基因,PEX家族的基因过表达将增加过氧化物酶体的数量,而过氧化物酶体中的各种酶对减轻盐碱胁迫带来的损伤至关重要。对20 mM NaHCO3处理后的细叶百合转录组进行测序,对转录组测序结果分析后找出了与盐碱关系较大的基因,并以此转录组序列为基础设计引物,以细叶百合鳞茎的cDNA为模板,克隆分别得到LpPEX5、LpPEX7基因序列,进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR分析基因的表达模式。并成功构建了 PBI121-LpPEX7和pMCP1-LpPEX5植物表达载体,通过农杆菌介导法转化到拟南芥中,对LpPEX5 OE、LpPEX7 OE基因的拟南芥进一步进行了抗逆性分析。同时构建了 pQE-LpPEX5和pGEX-LpPEX7蛋白表达载体并成功纯化蛋白,从而为LpPEX5、LpPEX7基因的进一步研究奠定基础。具体研究结果如下:1.通过对细叶百合鳞茎进行转录组测序,共获得23.4Gb的数据,通过组装得到115061条 unigene。将 Unigene 序列与 Nr、COG、Swissprot、KEGG 数据库进行 Blast 比对后,共获得56828个mRNA的注释信息。共鉴定出390个差异表达基因,其中有155个基因上调,235个基因下调。选取了 8个与盐碱胁迫密切相关的基因进行qRT-PCR验证,通过qRT-PCR结果说明了 RNA-Seq数据的可靠性。2.从细叶百合的鳞茎中成功克隆得到细叶百合的LpPEX5、LpPEX7基因,其中LpPEX5基因长度为2268 bp,编码755个氨基酸,LpPEX7基因长度为957 bp,编码318个氨基酸。保守结构域分析显示,LpPEX5基因属于TPR超家族,LpPEX7基因属于WD40超家族。3.荧光定量PCR结果显示LpPEX5和LpPEX7基因均在叶片和种子中表达量比较高。经过逆境胁迫处理后,LpPEX5和LpPEX7基因在NaCl和H2O2胁迫12 h时表达量达到最大;在NaHCO3胁迫24 h时达到最大表达量。4.构建了 PBI121-LpPEX7和pMCP1-LpPEX5植物表达载体,通过农杆菌介导法将重组质粒转入到拟南芥中,进行抗性筛选,成功得到过表达的LpPEX5、LpPEX7基因的拟南芥植株。并且成功的将LpPEX5和LpPEX7基因的过表达载体导入到细叶百合中。5.LpPEX7基因的拟南芥相较野生型拟南芥在盐碱环境下的发芽情况显示过表达LpPEX7基因的拟南芥相较于野生型拟南芥有了更强的盐碱抗性。6.构建了 pQE-LpPEX5和pGEX-LpPEX7,对LpPEX5和LpPEX7蛋白的诱导条件进行了探索,成功诱导出了蛋白并纯化。
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