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[研究目的]
脓毒症(sepsis)是临床危重病症中极为常见的一种并发症,病情凶险、病死率高。近年来,随着抗感染治疗和器官功能支持技术的长足进步,使得脓毒症的预后有一定的改善,但病死率仍高达30%~70%。脓毒症的发病机制相当复杂,近年来研究证实,免疫功能紊乱在脓毒症发生、发展过程中确实具有重要作用。脓毒症时免疫功能紊乱并不是以往所单一认为的“过度炎症反应”,更多的是由于“过度免疫抑制”所引起的。机体在早期经历了短暂的SIRS反应后是长期的代偿性抗炎反应综合征(CARS)和混合性抗炎反应综合征(MARS),导致炎症反应失控和内环境失衡,同时伴随有机体一系列免疫功能的改变——免疫效应细胞凋亡增加、膜分子表达变化、细胞因子分泌改变等。树突状细胞(DCs)是联系固有免疫及适应性免疫的桥梁,位于免疫调节网络的上游,是调节T淋巴细胞分化的关键。许多研究均证实,脓毒症可导致DCs凋亡增加,数量减少,且与死亡率密切相关。粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是DCs天然的活化刺激物,在脓毒症时血清浓度下降,且亦与预后相关。本研究拟观察外源性GM-CSF对脓毒症小鼠模型脾脏DCs数量、凋亡率及分泌IL-12能力的影响,同时观察生存率的变化,以探讨GM-CSF对脓毒症DCs的生物效应及临床应用价值。
[研究方法]
1、实验动物分组
GM-CSF对脓毒症小鼠脾脏DCs数量、凋亡率及血清IL-12的影响:选择体重25g(6~8周)雄性昆明鼠120只,随机分配入组。正常对照组:40只,不予特殊处理,正常喂养;CLP组:32只,盲肠结扎穿孔;常规治疗组:24只,CLP术后12、24、36、48、60、72、84h腹腔注射头孢曲松(上海罗氏)5mg/kg;GM-CSF治疗组:24只,CLP术后除常规治疗外另于12、36、60、84h皮下注射GM-CSF(美国PeproTech公司)20ug/kg。
GM-CSF对脓毒症小鼠生存预后的影响:雄性昆明鼠40只随机分配入正常对照组、CLP组、常规治疗组、GM-CSF治疗组,每组10只。累计96h时死亡及存活个数。
2、实验方法
各组于CLP术后0、12、24、48、72h分批处死小鼠(n=8),流式细胞仪测定各组脾脏DCs数量及凋亡率,ELISA法检测各组血清IL-12浓度。
3、统计方法
测量数据以均数±标准差((x)±s)表示,应用One-Way ANOVA方法进行统计分析;并应用Logist回归方法分析不同处理因素对于生存率的影响。以P>0.05为差异不显著、无统计学意义,P<0.05为差异具有统计学意义。
[结果]
1、脾脏DCs数量及凋亡率:CLP组在整个观察窗的所有时间点脾脏DCs凋亡增加,数量明显减少(P<0.05);常规治疗(头孢曲松)可以加剧DCs的丢失(P<0.05);GM-CSF可以增加脓毒症时脾脏DCs的数量(P<0.05),但由于本实验未设置GM-CSF单独治疗组,其效应部分与头孢菌素叠加,48、72h时和CLP组无差异(P>0.05),但通过Logist回归分析,可以看出GM-CSF是独立保护性因子(OR=0.079)。在增加DCs数量的同时,GM-CSF也增加其凋亡(P<0.05),推测是继于DCs活化的后效应,即所谓激活诱导细胞死亡(AICD)。
2、血清IL-12浓度:CLP组IL-12血清浓度表现为于12h高峰的单向曲线趋势(P<0.05);常规治疗(头孢曲松)对这一趋势无干预效应(P>0.05);GM-CSF干预后IL-12浓度显著下降(P<0.05),推测GM-CSF能够促进DCs分化成熟,增加其抗原呈递能力,同时减少IL-12的释放。
3、不同处理因素对于生存率的影响:Logist回归分析入选CLP及GM-CSF两因素,而剔除了常规治疗措施——头孢曲松,同时分析得GM-CSF是保护性因子(OR=0.079)。
[结论]
脓毒症时脾脏DCs凋亡增加、数量减少,IL-12释放增多,且GM-CSF血清浓度下降都提示预后不良。补充外源性GM-CSF可以增加DCs的数量,降低血清IL-12浓度从而改善预后。