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目的:临界性骨缺损（critical size defect,CSD）的修复是医学领域备受关注的问题,具有非侵入性的物理机械干预措施能够加快骨缺损的愈合,将物理因子刺激与骨缺损修复材料联合应用是优化骨缺损治疗的策略之一。低强度脉冲超声波（low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS）是一种非侵入性、脉冲式机械波,对骨缺损、骨折、骨不连以及骨关节炎具有治疗和保护作用,已被美国食品药品管理局批准应用于临床治疗骨折与骨不连。三维支架材料在针对CSD修复的骨组织工程中占据重要地位,其中多孔钛合金材料具有优良的生物学相容性和骨传导性,通过对其孔隙的调节可以使之具备与骨组织相匹配的力学性能,而且多孔钛合金的加工稳定性良好,因此在CSD的修复中受到关注,但是单纯采用多孔钛合金修复骨缺损,其成骨效应和新骨长入深度仍有不足。将非侵入性的LIPUS与多孔钛合金联合应用为CSD的治疗提供了新思路。课题组前期对LIPUS与多孔钛合金材料联合应用于骨缺损修复的体内外研究结果显示,LIPUS能显著促进体外成骨细胞在多孔材料内的迁移和成骨分化,并显著提高动物缺损模型中多孔支架材料内新骨形成的速度、长入深度和骨成熟度,加速骨愈合。LIPUS促进骨愈合的分子机制非常复杂,目前尚未被完全阐明,而LIPUS促进三维支架材料内成骨作用的内在分子机制目前未见报导,因此需要进一步的探索。随着对微小RNA（microRNA,miRNA）研究的不断深入,越来越多的miRNA被发现参与到成骨细胞的分化过程当中。miRNA对大部分的蛋白编码基因都存在调控作用,成熟的miRNA的5,端能够和靶基因的3,非翻译区（untranslated Regions,UTR）发生部分或完全互补配对,进而抑制信使核糖核酸（messenger RNA,mRNA）的翻译或使其发生降解,从而发挥调控作用。目前关于miRNA在LIPUS促进成骨分化和骨折愈合过程中的作用机制研究的比较少,而miRNA在LIPUS促进多孔材料成骨作用中的作用规律和机制尚未见报道。课题组前期对加载及未加载LIPUS的多孔钛合金材料上的成骨细胞进行了miRNA高通量测序,结果发现LIPUS作用下miR-1187表达显著下调,提示miR-1187可能在LIPUS促进多孔钛合金材料内成骨细胞的成骨分化行为中发挥调控作用。生物信息学预测分析结果显示骨形成蛋白4（bone morphogenetic protein 4,BMP4）是miR-1187的候选靶基因,BMP4是一种重要的生长因子,是BMP信号的配体之一,在骨发生发展过程中能够发挥调控作用。然而LIPUS是否能够通过miR-1187/BMP4轴调控多孔钛合金支架材料内小鼠前成骨细胞成骨分化,目前尚不清楚。综上所述,本研究将通过体内外实验探讨miR-1187/BMP4轴在LIPUS促进多孔钛合金材料内MC3T3-E1成骨分化过程中的作用,初步探寻LIPUS促进多孔钛合金材料内成骨作用的分子生物学机制,从而为“多孔材料联合LIPUS应用于修复CSD”的临床治疗方案提供理论指导。研究方法:（1）应用RT-qPCR检测LIPUS对miR-1187表达水平的影响;应用RT-qPCR和Western Blot检测LIPUS加载对成骨分化指标COL-1、ALP、RUNX2、OCN基因和蛋白表达水平的影响;在MC3T3-E1细胞中转染miR-1187模拟物和抑制物（miR-1187 mimics,miR-1187 inhibitor）,应用RT-qPCR、Western Blot、ALP活性、ALP染色、茜素红染色评价miR-1187对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响;应用RT-qPCR、Western Blot实验评价LIPUS与miR-1187 mimics转染共处理对支架材料上细胞成骨分化指标基因和蛋白表达水平的影响。（2）应用RT-qPCR、Western Blot、ELISA实验评估LIPUS对BMP4基因和蛋白表达水平的影响;应用RT-qPCR、Western Blot及荧光素酶实验证明miR-1187与BMP4的靶向关系;应用RT-qPCR、Western Blot、ALP活性、ALP染色、茜素红染色检测沉默和过表达BMP4对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响;应用RTqPCR、Western Blot、ALP活性检测共转染miR-1187mimics与BMP4过表达质粒,miR-1187 mimics转染与LIPUS加载共处理对支架材料上成骨分化标志物mRNA和蛋白表达水平的影响,通过回复性实验验证LIPUS可通过调控miR-1187/BMP4轴促进支架材料内成骨细胞的成骨分化。（3）在大鼠下颌骨前牙区制备临界骨缺损,并植入与骨缺损大小规格一致的多孔钛合金支架材料,大鼠被随机分成Control组、LIPUS组、si-BMP4组和si-BMP4+LIPUS组,周期性的将等体积的si-BMP4或PBS通过局部注射的方式注射入各组骨缺损区。在4 w和8 w两个时间点,通过micro-CT、甲苯胺蓝染色、Von Kossa银染观察新生骨组织在支架材料内长入及成熟情况;利用RT-qPCR检测支架材料内骨组织中Bmp4以及成骨相关因子Col-1、Alp、Runx2、Ocn基因表达水平的改变.结果:（1）LIPUS促进多孔钛合金材料上MC3T3-E1细胞的成骨分化的同时明显下调了miR-1187的表达（P＜0.05）;转染miR-1187 mimics明显下调了COL-1、ALP、RUNX2等成骨分化标志物基因和蛋白的表达水平（P＜0.05）,并显著抑制ALP活性和基质矿化（P＜0.05）,这些指标的变化在转染miR-1187inhibitor后得到相反结果,表明miR-1187可以抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化;LIPUS加载能在一定程度上拮抗miR-1187 mimics转染对支架材料上MC3T3-E1细胞的成骨分化的抑制。（2）LIPUS加载显著上调了BMP4在mRNA和蛋白水平的表达（P＜0.05）;荧光素酶实验结果显示pmir GLO-BMP4 3’UTR（WT）+miR-1187 mimics组荧光素酶活性显著低于其他组（P＜0.05）,提示miR-1187可以与BMP4上的预测结合位点直接结合,而转染miR-1187 mimics和inhibitor则能分别显著下调和上调BMP4的表达（P＜0.05）,miR-1187与BMP4具有靶向结合调控关系;沉默和过表达BMP4能分别显著下调和上调MC3T3-E1细胞内成骨分化标志物ALP、COL-1、RUNX2的基因和蛋白表达水平（P＜0.05）,表明BMP4能够正向调控MC3T3-E1细胞的成骨分化;LIPUS和BMP4过表达质粒的共转染均能在一定程度上分别拮抗和回复单纯转染miR-1187 mimics对支架材料上MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制。（3）在4 w和8 w两个时间点,Micro-CT、硬组织切片染色组织学观察结果均显示si-BMP4组新骨形成最少,Control组和LIPUS+si-BMP4组新骨形成量优于si-BMP4组,而LIPUS组优于Control组和si-BMP4+LIPUS组（P＜0.05）;Von Kossa银染结果显示,在各个时间点si-BMP4组的矿化沉积物IOD值均最低,Control组和LIPUS+si-BMP4组矿化沉积物IOD值优于si-BMP4组,而LIPUS组优于Control组和siBMP4+LIPUS组（P＜0.05）。以上结果表明LIPUS和si-BMP4能够分别促进和抑制大鼠下颌骨支架材料内新骨的生成和成熟,而且LIPUS能够在一定程度上拮抗si-BMP4对支架材料内新骨生成及骨成熟的抑制作用;RT-qPCR结果显示LIPUS能够上调Bmp4基因的表达水平,并上调相关成骨分化标志物Col-1、Alp、Runx2、Ocn的基因表达水平,干扰大鼠骨缺损区Bmp4基因的正常表达则抑制了支架材料骨组织内Col-1、Alp、Runx2、Ocn的基因表达水平,LIPUS能够一定程度上拮抗si-BMP4对骨组织内Col-1、Alp、Runx2、Ocn基因表达水平的抑制作用。结论:（1）miR-1187负向调控MC3T3-E1细胞的成骨分化,体外实验中LIPUS能够通过下调多孔钛合金内MC3T3-E1细胞miR-1187的表达来促进成骨细胞的成骨分化（2）miR-1187与BMP4具有靶向调控关系;BMP4能正向促进MC3T3-E1细胞的成骨分化;LIPUS能通过降低miR-1187的表达,拮抗miR-1187对靶基因BMP4的抑制,从而促进多孔钛合金支架材料上MC3T3-E1细胞的成骨分化。（3）体内实验中,LIPUS可通过调控BMP4的表达上调大鼠下颌骨骨缺损区支架材料内成骨分化标志物基因水平的表达进而促进骨组织的生成和成熟。