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目的:关节软骨缺损在临床中发病率较高,可由创伤、肿瘤和关节退变等多种原因引起,由于其无血管、无神经以及无淋巴回流的特殊结构,自我修复能力有限,且长期不愈易导致骨关节炎的发生。目前临床使用的手术方法包括微骨折术、自体软骨细胞移植和自体或异体骨软骨移植术等,只能在短期缓解疼痛和肿胀等症状,大多情况下会形成强度较差的纤维组织或纤维软骨,并不具备健康关节软骨的承载性和耐久性,无法达到理想的治疗效果。牙源性干细胞具有优异的多谱系分化能力,为关节软骨缺损的治疗提供了新的方向。牙源性干细胞可从拔除的阻生齿及正畸牙中获得,其获取过程创伤较小且具有低免疫原性和免疫调节的能力,这些独特的优势使其成为临床应用中更好的种子细胞选择。目前在口腔研究领域已经分离鉴定出至少7种牙源性间充质干细胞,包括牙髓干细胞、牙周膜干细胞、牙龈干细胞、牙囊干细胞、脱落乳牙干细胞、根尖牙乳头干细胞和牙槽骨骨髓间充质干细胞。从不同部位分离出的牙源性干细胞具有不同的多谱系分化能力,目前针对牙源性干细胞的成软骨分化能力尚无完整的体内外研究。综上,本研究以牙源性干细胞为切入点,通过体外实验、裸鼠皮下埋植实验和大鼠膝关节全层软骨缺损的修复实验,比较了牙髓干细胞（DPSCs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）、牙槽骨骨髓间充质干细胞（ABMMSCs）这三种常见牙源性干细胞的软骨再生潜能,并通过体内外实验探究了转录因子TTF1及其相互作用转录因子GLIS1对DPSCs成软骨分化的调控作用,为DPSCs应用于关节软骨缺损的治疗提供理论基础。研究方法:1.从同一个体（n=5）分离培养DPSCs、PDLSCs和ABMMSCs,采用流式细胞术和三系分化实验对其进行鉴定;通过qRT-PCR、Western blot和免疫组化染色的手段对DPSCs、PDLSCs和ABMMSCs进行成软骨分化能力的体外比较研究;通过裸鼠皮下埋植实验和大鼠膝关节全层软骨缺损的修复实验进一步对三种MSCs的体内软骨修复能力进行比较。2.对DPSCs、PDLSCs和ABMMSCs三种细胞进行蛋白质表达谱鉴定,统计并分析蛋白组学结果,分别对D PL、D A、PL A这三组的差异蛋白进行生物信息学分析,筛选出与软骨分化相关的差异蛋白,并预测与其结合的转录因子。通过数据分析,选取TTF1和GLIS1为目标转录因子。3.通过慢病毒载体将TTF1与GLIS1分别转染到DPSCs中,成功构建过表达与敲低TTF1和GLIS1的DPSCs,之后在体外进行成软骨诱导分化的功能回复实验,通过Western blot和免疫组化检测软骨相关指标在蛋白与功能水平的变化;通过免疫共沉淀与免疫荧光共定位检测TTF1与GLIS1与是否存在相互作用;体内通过建立大鼠膝关节全层软骨缺损模型探究了 TTF1及GLIS1对DPSCs软骨缺损修复能力的影响。结果:1.DPSCs、PDLSCs和ABMMSCs均高表达间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146,低表达造血干细胞标志物 CD24、CD34、CD45。成骨诱导3周后,茜素红染色可见矿化结节;成脂诱导3周后,油红O染色可见红色圆形脂滴;成软骨诱导2周后,阿利新蓝染色可见酸性粘多糖,且DPSCs的SOX9、COL2A1与ACAN在mRNA和蛋白层面的表达量均高于PDLSCs和ABMMSCs（P＜0.05）。2.裸鼠皮下埋植异位成软骨实验显示,三种MSCs均没有形成肿瘤样组织。DPSCs形成的组织为光滑半透明状,与透明软骨的颜色较为接近;PDLSCs形成的为白垩色不透光组织;ABMMSCs所形成的组织部分为白垩色,部分为半透明,且夹杂黄褐色骨样结构。HE染色与免疫荧光染色进一步证实了 DPSCs可形成大量Ⅱ型胶原和少量的Ⅰ型胶原;PDLSCs仅可形成少量Ⅱ型胶原,以Ⅰ型胶原为主,与纤维结缔组织更为相似;ABMMSCs成软骨分化能力居中,更倾向于骨向分化。大鼠膝关节软骨缺损区的HE、番红O-固绿与免疫组化染色结果显示,与单纯软骨缺损组和单纯支架材料组相比,DPSCs组的缺损修复区内Ⅱ型胶原和ACAN增多,而Ⅰ型胶原相对较少,与假手术组最为接近;PDLSCs组以Ⅰ型胶原为主;ABMMSCs组Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和ACAN均增多,其中Ⅰ型胶原比例较高,HE染色可见典型的骨样结构。3.基于TMT质谱技术,在DPSCs、PDLSCs、ABMMSCs三者中共鉴定到4223个蛋白。对DPL、DA、PLA这三组进行GO富集分析,以差异大于1.5倍且P＜0.05为条件筛选,将表达量前30的差异蛋白做GO功能分析后发现,这些蛋白主要与细胞成分、细胞结合、催化活化和生物学调节等功能密切相关,并从中进一步筛选出了与软骨分化相关的差异蛋白,预测了与其相结合的转录因子TTF1和GLIS1。4.通过构建慢病毒载体将TTF1和GLIS1分别转染到DPSCs中,体外研究结果表明,过表达TTF1可促进DPSCs成软骨分化,敲低TTF1可抑制DPSCs成软骨分化;过表达GLIS1可抑制DPSCs成软骨分化,敲低GLIS1可促进DPSCs成软骨分化。体内实验发现,过表达TTF1或敲低GLIS1的DPSCs可修复大鼠膝关节全层软骨缺损,缺损区新生修复组织含有大量Ⅱ型胶原,细胞排列有序。免疫共沉淀和免疫荧光共定位结果显示,TTF1与GLIS1存在相互作用,过表达TTF1后GLIS1随之降低,且过表达TTF1能够激活Smad5信号通路,提示过表达TTF1促进DPSCs成软骨分化可能通过抑制GLIS1的表达并激活Smad5信号通路从而促进软骨基质的合成。结论:1.异体牙源性间充质干细胞移植可促进关节软骨损伤的软骨性修复。其中,DPSCs的成软骨分化能力最强,形成的软骨结构与正常膝关节透明软骨最接近;PDLSCs形成的大多为纤维结缔组织;ABMMSCs成软骨分化能力居中,且更倾向于骨向分化。2.通过TMT质谱对三种干细胞进行检测共得到4223个蛋白,以差异大于1.5倍且P＜0.05为条件筛选,DPL、DA和PLA三组差异蛋白数量分别为88、437和171个,进一步筛选与软骨分化相关的差异蛋白共8个,转录因子TTF1和GLIS1可以与其中6个蛋白相结合。3.过表达TTF1可促进DPSCs成软骨分化,敲低TTF1可抑制DPSCs成软骨分化;过表达GLIS1可抑制DPSCs成软骨分化,敲低GLIS1可促进DPSCs成软骨分化。过表达TTF1促进DPSCs成软骨分化可能通过抑制GLIS1的表达并激活Smad5信号通路从而促进软骨基质的合成。