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目的:人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）已被充分证明可被用作牙组织工程的理想种子细胞。深入了解hDPSCs成牙本质向分化的具体分子机制,明确调节该过程的关键分子,不仅对牙髓-牙本质复合体再生组织工程至关重要,还将为牙体牙髓疾病的治疗提供新的方向。活化转录因子4（activating transcription factor 4,ATF4）在正常情况下呈低浓度稳态表达,但在内质网应激、炎症和氨基酸缺乏等应激信号出现后其表达水平迅速上调,激活后可以特异性地提高某些靶基因转录效率。ATF4能够显著促进成骨细胞分化,并增强骨形成能力。牙本质形成与骨组织发育、矿化过程相似,但ATF4在hDPSCs向成牙本质细胞样细胞分化过程中的具体作用还尚未见报道。人类肺腺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1）是一种高度保守的长链非编码RNA,最初通过差异表达从非小细胞肺癌患者肿瘤细胞中筛选被发现。除了促进肿瘤发生外,研究发现MALAT1还可以促进干细胞向成骨分化或成牙本质分化。含十字形结构域蛋白3（jumonji domain-containing 3,JMJD3）是一种组蛋白去甲基化酶,它可使组蛋白H3上被三甲基化的第27位赖氨酸残基（trimethylation on histone H3 lysine 27,H3K27me3）特异性地移去甲基,使基因的转录由抑制状态转化为激活状态。研究表明,JMJD3可以通过减少矿化相关基因启动子区域H3K27me3修饰水平来促进牙源性间充质干细胞的牙向分化。然而,MALAT1能否与JMJD3直接结合,通过调控成牙本质向分化标志基因牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1,DMP1）和牙本质涎磷蛋白（dentin sialophoshoprotein,DSPP）启动子区域H3K27me3水平来促进hDPSCs成牙本质向分化尚不清楚。本研究的目的是评估ATF4和MALAT1在hDPSCs成牙本质向分化中的作用以及两者之间的关系。进一步阐明MALAT1是否可以与组蛋白去甲基化酶JMJD3直接结合,招募JMJD3表观遗传调控DSPP和DMP1,从而促进hDPSCs成牙本质向分化。方法:一、ATF4促进hDPSCs成牙本质向分化1、流式细胞术检测hDPSCs表面标志物;2、real-time PCR和western blot检测ATF4在hDPSCs成牙本质向分化过程中的表达;3、利用小干扰RNA和慢病毒载体分别沉默和过表达ATF4,real-time PCR和western blot检测DSPP和DMP1的表达,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色检测hDPSCs分化水平。二、ATF4调控的MALAT1促进hDPSCs成牙本质向分化1、免疫荧光染色或核质分离检测ATF4和MALAT1在hDPSCs成牙本质向分化过程中的亚细胞定位;2、Ch IP-PCR明确ATF4与MALAT1启动子区的结合情况;3、沉默ATF4后,real-time PCR检测MALAT1的表达变化;4、realtime PCR检测MALAT1在hDPSCs成牙本质向分化过程中的表达变化;5、利用小干扰RNA沉默MALAT1,real-time PCR和western blot检测DSPP和DMP1的表达,ALP染色检测细胞分化水平。三、MALAT1通过JMJD3表观遗传调控DSPP、DMP1促进hDPSCs成牙本质向分化1、real-time PCR和western blot检测JMJD3在hDPSCs成牙本质向分化过程中的表达变化;2、采用逆转录病毒稳定过表达JMJD3,real-time PCR和western blot检测DSPP和DMP1的表达;3、RIP实验验证MALAT1与JMJD3直接结合;4、沉默MALAT1,real-time PCR和western blot检测JMJD3表达变化,荧光试剂盒法检测JMJD3活性变化;5、沉默MALAT1,Ch IP-q PCR检测DSPP、DMP1启动子区H3K27me3富集水平;6、同时沉默MALAT1和过表达JMJD3,real-time PCR和western blot检测DSPP和DMP1的表达,ALP染色检测细胞分化水平。结果:一、ATF4促进hDPSCs成牙本质向分化1、随着分化时间的增加,成牙本质向分化标志分子ALP、DMP1和DSPP m RNA表达逐渐升高,ATF4 m RNA和蛋白表达水平在成牙本质向分化诱导3 d时显著升高;2、沉默ATF4,DSPP、DMP1 m RNA和蛋白表达显著下降,ALP活性明显减弱;过表达ATF4,DSPP和DMP1 m RNA和蛋白表达显著升高,ALP活性明显增强。二、ATF4调控的MALAT-1促进hDPSCs成牙本质向分化1、ATF4蛋白分布在hDPSCs的细胞核和细胞质内,成牙本质向分化诱导3d细胞核内ATF4蛋白表达水平显著增加;MALAT1在成牙本质向分化诱导0 d和3 d均主要集中分布于细胞核;2、ATF4可以与MALAT1转录起始点前388-376碱基和1408-1396碱基区域直接结合;3、沉默ATF4,MALAT1表达水平显著降低;4、随着分化时间的增加,MALAT1表达水平逐渐增高;5、沉默MALAT1,DSPP和DMP1 m RNA和蛋白表达显著下降,ALP活性明显减弱。三、MALAT1通过JMJD3表观遗传调控DSPP、DMP1促进hDPSCs成牙本质向分化1、成牙本质向分化诱导培养后,JMJD3 m RNA和蛋白表达水平均明显增高;2、过表达JMJD3,DSPP和DMP1 m RNA和蛋白表达显著升高;3、成牙本质向分化诱导促进JMJD3与MALAT1的结合;4、沉默MALAT1显著降低JMJD3的蛋白水平及酶活性,但不影响JMJD3 m RNA表达;5、沉默MALAT1,DSPP、DMP1启动子区H3K27me3富集水平显著升高;6、过表达JMJD3能够减弱沉默MALAT1所引起的DSPP和DMP1 m RNA、蛋白水平的抑制以及ALP活性的抑制。结论:1、ATF4促进hDPSCs成牙本质向分化;2、ATF4直接转录调控MALAT1;3、沉默MALAT1抑制hDPSCs成牙本质向分化;4、JMJD3促进hDPSCs成牙本质向分化;5、MALAT1通过结合JMJD3,增加JMJD3蛋白水平及酶活性,介导DSPP和DMP1启动子区H3K27me3脱甲基,激活DSPP和DMP1的转录,进而发挥促进hDPSCs成牙本质向分化作用。