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目的1.研究程序性死亡分子配体-1(Programmed Death Ligand-1,PD-L1)、UL16结合蛋白3(UL16 Binding Proteins 3,ULBP3)及UL16结合蛋白4(UL16 Binding proteins 4,ULBP4)在头颈部肿瘤的表达状态与临床病理特征的关系。2.探讨ULBP3、ULBP4及PD-L1共同调控特异性T细胞对鼻咽癌细胞的杀伤机制。方法1.本研究纳入癌症基因组图谱据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)自1992年-2013年经病理确诊的500例头颈部肿瘤病例,均有完整的临床病理数据及转录组数据。运用Pearson相关法分析CD8、IFN-γ、PD-L1、ULBP3以及ULBP4表达的相关性。采用卡方检验分析临床病理特征与CD8、IFN-γ、PD-L1、ULBP3以及ULBP4表达水平的关系。上述各个分子在癌组织及正常组织差异表达比较采用配对样本t检验。2.分离外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),经流式细胞术提纯CD8+T细胞,通过树突状细胞(Dendritic Cells,DC)诱导形成特异性CD8+T淋巴细胞;采用CRISPR/Cas9敲除鼻咽癌细胞株5-8F的ULBP3和ULBP4基因,对5-8F鼻咽癌细胞株转染PD-L1过表达载体。基因测序及流式细胞术检测5-8F基因敲除后的ULBP3、ULBP4表达状态,流式细胞术及Western-blot鉴定转染过表达载体后的5-8F的PD-L1表达情况。特异性T细胞与已构建的不同PD-L1、ULBP3、ULBP4表型的5-8F鼻咽癌细胞株共培养,采用CFSE-PI-流式法鉴定特异性T细胞对不同表型鼻咽癌细胞株的杀伤作用。结果第一部分:1.Pearson相关性分析提示IFN-γ表达与CD8、PD-L1呈现正相关(R=0.765,P<0.0001;R=0.453,P<0.0001),与ULBP3呈现负相关(R=-0.239,P<0.0001),CD8表达与PD-L1表达呈现正相关(R=0.337,P<0.0001),CD8表达与ULBP3表达呈现负相关(R=-0.224,P<0.0001),PD-L1表达与ULBP3表达呈弱负相关(R=-0.113,P=0.0115)。2.各个分子表达量与临床病理特征的分析表明,组织学分级高的肿瘤组织中,ULBP3、ULBP4表达显著降低,而CD8表达升高(P=0.001,P=0.000,P=0.015)。男性相对于女性患者,呈现ULBP4低表达水平(P=0.000);高龄患者CD8及IFN-γ呈现高表达水平(P=0.032,P=0.032)。3.癌组织的CD8、IFN-γ、PD-L1及ULBP3相较于正常组织高表达(P=0.017,P=0.001,P=0.000,P=0.000),癌组织的ULBP4表达水平相较于正常组织低(P=0.022)。第二部分:1.分离的PBMC经扩增后,通过流式细胞术分选和提纯,CD8+T细胞比例由49.13%上升至92.57%。经过CRISPR/Cas9敲除处理,基因测序及流式细胞术验证5-8F的ULBP3、ULBP4已被成功敲除。在转染过表达载体后,Western-blot及流式细胞术均验证5-8F的PD-L1已被过表达。2.随着效靶比的增加,CD8+T细胞对5-8F的杀伤比例显著增加。在不同效靶比,PD-L1oe-5-8F、ULBP3ko-5-8F、ULBP4ko-5-8F、ULBP3ko-PD-L1oe-5-8F及ULBP4ko-PD-L1oe-5-8F均能导致CD8+T细胞的杀伤功能的降低。CD8+T细胞对ULBP3ko-PD-L1oe-5-8F及ULBP4ko-PD-L1oe-5-8F的杀伤效率最低。结论1.IFN-γ、CD8与PD-L1正相关,与ULBP3负相关,表明IFN-γ上调PDL1的同时,可能参与了头颈部肿瘤ULBP3的表达下调。2.高组织学分级的头颈部肿瘤存在ULBP3、ULBP4低表达及CD8高表达。并且,肿瘤组织CD8、IFN-γ、PD-L1及ULBP3表达高于正常组织,提示这些蛋白共同参与了肿瘤发生发展及免疫逃逸,但肿瘤组织的ULBP4表达低于正常组织。3.ULBP3-4/NKG2D活化性通路与PD-1/PD-L1抑制性通路共同影响了CD8+T细胞的杀伤功能,ULBP3、ULBP4的表达下调可能参与了头颈部肿瘤PD-1抑制剂的耐药。