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IBM1（INCREASE IN BONSAIMETHYLATION 1）是组蛋白H3K9的去甲基化酶,能够清除活跃转录基因上的组蛋白H3K9甲基化,从而导致活跃转录基因上不能形成CHG甲基化。拟南芥中2个反沉默因子ASI1（ANTI-SILENCING 1）和EDM2（ENHANCED DOWNYMILDEW2）通过桥蛋白 ASI1-免疫沉淀蛋白 1 即AIPP1（ASI1-IMMUNOPRECIPITATED PROTEIN 1）在体内形成蛋白质复合物来维持IBM1的功能性表达。EDM2对维持IBM1的正常表达有重要作用;edm2突变体中IBM1的表达量明显下降,因此,edm2突变体和ibm1突变体表现出相似的发育表型,如株高变矮、分枝增加、叶片变小、颜色深绿、部分花器官发育异常、降低的结实率和发育缺陷的种子。为了探索引起edm2异常表型的原因,并探讨ibm1突变引起的CHG甲基化升高是否被RNA指导的DNA甲基化途径（RNA-directed DNA methylation,RdDM）基因的突变所影响,我们将edm2与RdDM途径突变体和ros1突变体（ROS1是一个DNA去甲基化酶）进行杂交,获得了一系列的双突变体,即edm2 rdm1、edm2 ago4、edm2 ros1和edm2 nrpd1。表型鉴定的结果表明,edm2 rdm1、edm2 ago4、edm2 ros1可以恢复edm2幼苗的发育缺陷,但edm2nrpd1却加剧了幼苗的发育缺陷。我们对这些突变体进行了全基因组DNA甲基化和转录组测序,并利用生物信息学技术进行分析,发现这些双突变体中的活跃基因上的CHG甲基化发生了改变,并且参与IAA（indole-3-acetic acid）、GA（gibberellins）和防御反应有关的基因表达也发生了变化,它们共同作用影响了edm2突变体的发育表型。具体结果如下:1.前人的研究认为,edm2发育表型是由于IBM1的表达下降而造成BNS（BONSAI）基因发生高甲基化,从而使其基因表达降低所引起的。本研究的结果表明,BNS基因在edm2rdm1,edm2 ago4和edm2 ros1中的表达较为丰富,但在edm2 nrpd1中表达较少。然而,通过分析甲基化测序数据发现,与edm2突变体相比,只有edm2 rdm1双突变体显示出BNS位点的甲基化水平下降;相反,BNS基因在edm2 ros1双突变体中甲基化反而升高。这些结果表明,BNS基因的表达不完全受DNA甲基化的控制。2.对双突变体进行全基因组DNA甲基化分析发现,edm2突变体中引入rdm1或ago4突变体可以明显降低edm2突变体中一些基因上的CHG超甲基化。因此,认为RdDM途径可能在某些区域帮助建成和稳定由edm2突变引起的CHG甲基化。此外,在edm2背景下引入ros1突变体后可以明显增加许多基因座的CHG甲基化。所以,我们认为由edm2突变体引起的全基因组活跃基因上的CHG甲基化可能在某些位点被ROS1抑制。然而,edm2突变体引入nrpd1突变体既可以在某些基因上增加CHG甲基化,又可以在另一些基因上减弱CHG甲基化,且CHG增加的基因数量多于CHG甲基化被抑制的基因数量。我们推测NRPD1可能在某些基因上具有抑制CHG甲基化的作用,但在另一些基因上则发挥着协助CHG甲基化建成的作用,或者通过影响RdDM途径而影响CHG甲基化,这与RDM1和AGO4类似。另一种可能性是,edm2 nrpd1中大量的这些高CHG甲基化基因是由于ROS1表达量降低所引起的。因此,通过分析,我们认为,edm2/ibm1突变体中的CHG甲基化受到RdDM途径和ROS1介导的DNA去甲基化途径的影响。3.mRNA测序结果表明,rdm1、ago4、ros1和nrpd1突变体影响了植物激素IAA、GA等相关基因的表达,从而影响了edm2的发育表型。在edm2单突变体中,生长素的生物合成和信号转导基因的表达被抑制,产生植株矮化表型。然而,双突变体通过升高或降低这些基因减弱或加重了这种植株矮化表型;edm2突变体中GA介导的信号传导通路有关的几个基因的表达均显著下降,而edm2rdm1和edm2 ago4突变体中已恢复到类似野生型Col-0水平,说明edm2突变体可能通过减弱GA信号通路而导致植株变矮等表型,以及rdm1和ago4通过未知的机制重新恢复了GA信号通路。4.mRNA测序结果还显示,edm2突变体中与植物防御反应相关的大量基因表达明显增高,例如对寒冷的反应,对盐胁迫的反应,对损伤的反应,对紫外线的反应以及对脱落酸的反应等。然而,这些基因在edm2rdm1,edm2ago4和edm2ros1中表达的恢复或部分恢复了,而在edm2nrpd1中却进一步增高了。edm2突变体相比于Col-0具有更高的ABA含量,表现出对ABA增强的敏感性。这些结果都表明,edm2突变体的异常发育表型很可能是防御相关的基因的过度表达而引起的。5.此外,pro35S:EDM2超表达转基因系与edm2相比,恢复了与生长素应答,GA应答和防御应答相关的基因的表达水平,这暗示了上述双突变体中这些基因恢复表达是以一种不依赖于EDM2的途径实现的,推测双突变体可能影响了 EDM2的下游目标靶基因的表达。综上所述,本研究发现,RDM1、AGO4、ROS1和NRPD1突变通过改变BNS基因的表达、生长素、GA和ABA相关激素基因的表达、以及与防御相关的基因的表达来减弱或增强edm2的植株发育表型,这显示了edm2/ibm1突变体中活跃转录基因上CHG甲基化的建成受到了 RdDM途径和ROS1的影响。据此,我们推测某些EDM2/IBM1的下游靶基因也同样是RdDM途径或ROS1的作用位点。