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背景:缺血性心脏疾病(Ischemic heart disease,IHD)常导致患者心肌梗死(myocardial infarction,MI)和心力衰竭(heart failure,HF),即使在药物和早期介入治疗后,死亡率仍居高不下。许多研究已证实利用干细胞(stem cells)移植可以减少心肌细胞凋亡、抑制心脏重构、通过旁分泌机制改善受损的心脏功能。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因其具有易于分离、培养、增殖及免疫耐受等优点,移植后可以通过旁分泌作用分泌多种细胞生长因子,促进毛细血管再生同时抑制心肌细胞凋亡,具有广泛的应用前景。然而,由于移植后缺血区域的不利微环境,干细胞的滞留率和存活率较低,其疗效受到制约。因此,需要探讨进一步的有效手段以改善BMSCs移植在治疗IHD中的疗效。胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)因其结构类似于胰岛素而得名,它在人体中具有多种功能;包括促进细胞存活和增殖、组织生长发育、抗衰老、抗氧化及神经保护作用等。多项研究发现IGF-1在干细胞移植过程中也发挥积极作用,如促进移植后的干细胞在心肌梗死区域存活、增殖甚至分化为心肌样细胞,但其机制尚未完全明确。经典的Wnt信号通路广泛参与基因表达、细胞运动、干细胞增殖分化等各种生理活动,其各个组分在间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)中均有表达,提示Wnt信号在MSCs的生物学功能中起着重要作用。有报道称,经典Wnt信号系统的表达,可以促进MSCs分化,同时抑制其增殖和迁移能力,但详细的作用机制尚不明确。分泌型卷曲相关蛋白2(secreted frizzled related protein 2,SFRP2)最早被认为是经典Wnt信号通路的抑制剂,但后续不少研究指出其可能在某些情况下反而可以维持甚至激活经典Wnt信号通路。有研究发现SFRP2在蛋白激酶B(AKT/PKB)过表达的MSCs(AKT-MSCs)移植治疗心肌梗死中发挥了关键作用。在沉默SFRP2基因后,AKT-MSCs原有的保护作用消失。IGF-1能够通过PI3K/AKT途径对Wnt信号系统起到重要调节作用,从而影响下游基因的转录。而在脂肪干细胞中,IGF-1能够通过PI3K/AKT通路促进SFRP2分泌。因此在本研究中,我们尝试通过在BMSCs中过表达IGF-1基因,探讨其能否进一步改善BMSCs移植治疗急性心肌梗死的疗效,以及SFRP2-Wnt信号通路在其中的作用,并进一步探索其可能的分子机制。目的:评估IGF-1改善急性心肌梗死后BMSCs移植治疗的效果,并阐述可能存在的机制。方法:我们首先利用全骨髓贴壁培养法分离培养SD大鼠BMSCs,并通过流式细胞仪检测细胞表面标志物CD73、CD105、CD90和CD45鉴定其纯度。随后通过慢病毒构建过表达IGF-1的骨髓间充质干细胞(BMSCs-IGF-1)以及仅含有空载体的BMSCs作为对照(BMSCs-NC)。将BMSCs-IGF-1和BMSCs-NC于低氧及常氧状态下培养48h,随后使用MTS方法检测细胞增殖,Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bc12、Bax及干性相关蛋白OCT4、Nanog的表达,Transwell实验检测细胞迁移能力,TUNEL法检测细胞凋亡,以比较低氧和常氧状态下BMSCs-IGF-1和BMSCs-NC细胞增殖、迁移能力、干性及细胞凋亡情况的差异。随后我们进行了相关通路的探索性研究,使用Western Blot检测AKT/SFRP2蛋白的表达:通过AKT抑制剂LY294002阻断BMSCs中的PI3K/AKT通路,随后使用Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达,MTS检测其增殖能力变化。通过SFRP2-siRNA敲减BMSCs-IGF-1细胞中SFRP2表达,判断SFRP2基因在BMSCs-IGF-1发挥促进增殖、抗凋亡、促进细胞迁移中的作用。为评价BMSCs-IGF-1保护H9C2大鼠心肌细胞对抗低氧引起的损伤,将H9C2大鼠心肌细胞与BMSCs-IGF-1、BMSCs-NC进行共培养,并将细胞暴露于低氧条件下48 h。最后在动物实验中,我们通过结扎SD大鼠冠状动脉建立急性心肌梗死模型,一周后通过尾静脉分别移植约1×106的BMSCs-IGF-1、BMSCs-NC和同体积的溶剂(对照组)。在移植三周后,利用心脏彩超评估上述三组SD大鼠的心脏功能变化,并进行组织学分析评估各组心脏纤维化情况,Western Blot检测各组心脏组织中AKT/SFRP2通路中各类蛋白的表达以评估IGF-1在改善BMSCs移植治疗急性心肌梗死中的作用机制。结果:1.IGF-1过表达可以抑制低氧诱导的BMSCs损伤。1.1体外培养的BMSCs细胞形态较小,呈三角形或纺锤状,特征性地黏附于培养皿表面。流式细胞仪检测BMSCs表面抗原CD73,CD105和CD90的表达比例分别为99.8%,97.0%和99.8%,仅0.55%的细胞表达CD45。随后使用慢病毒构建过表达IGF-1的BMSCs(BMSCs-IGF-1),通过ELISA测定BMSCs-IGF-1培养基中分泌的IGF-1的水平,比BMSCs-NC高出4倍(95%置信区间:2.52-6.35)。1.2将BMSCs-IGF-1和BMSCs-NC暴露于低氧环境48 h,通过MTS分析检测细胞活力:在低氧条件下,BMSCs的增殖能力明显被抑制,但IGF-1过表达明显改善这一情况。TUNEL染色表明IGF-1将低氧诱导的细胞凋亡数量降低了 25%(95%置信区间:11%-37%)。Transwell实验发现在低氧情况下,BMSCs-IGF-1穿过小室的细胞数量明显多于BMSCs-NC(P<0.01)。1.3 Western blot 检测细胞凋亡相关蛋白 cleaved caspase-3、BAX、BCL-2 的表达:低氧条件下,BMSCs-NC细胞中cleaved caspase-3及BAX升高,BCL-2降低;而 BMSCs-IGF-1 相比 BMSCs-NC,BCL-2 的表达增加,cleaved caspase-3及BAX则减少(P<0.01)。低氧条件下,BMSCs-NC中的OCT4和NANOG表达降低,而IGF-1过表达则显著恢复其表达(P<0.01)。2.IGF-1改善BMSCs增殖、迁移和抗凋亡能力的可能机制2.1 Western blot结果表明,低氧和常氧条件下培养48小时后,BMSCs-IGF-1中p-AKT和SFRP2蛋白表达均相比BMSCs-NC更高;暴露于低氧条件下,BMSCs中的p-AKT和SFRP2表达下降,而IGF-1过表达可逆转这一情况(P<0.05);低氧降低了 BMSCs-IGF-1 和 BMSCs-NC 中的总细胞β-catenin 水平。然而,在低氧和常氧状态下,BMSCs-IGF-1中的总细胞β-catenin水平均高于BMSCs-NC(P<0.05)。在常氧和低氧下,BMSCs-IGF-1 中β-catenin 下游蛋白cyclin D1和c-Myc表达水平高于BMSCs-NC(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示在低氧和常氧下,BMSCs-IGF-1中核内β-catenin水平明显高于BMSCs-NC(P<0.001)。以上结果表明了 IGF-1可能通过AKT信号通路促进了 SFPR2的表达,进一步调节BMSCs中β-catenin的表达发挥生物学作用。2.2为探讨AKT通路在BMSCs-IGF-1生物学特性中的作用,我们进一步使用AKT抑制剂LY294002阻断BMSCs中的PI3K/AKT通路,结果发现BMSCs-IGF-1的增殖和迁移能力明显减弱,过表达IGF-1所带来的SFRP2、β-catenin、c-Myc,BCL-2表达增加,BAX表达降低等下游分子的改变均被LY294002预处理所减弱(P均<0.01)。2.3 我们进一步构建了 BMSCs-IGF-1-si-SFRP2 和 BMSCs-IGF-1-siNC 以探讨SFRP2在IGF-1改善BMSC生物学特性中的作用。设计以下5组进行后续实验:常氧+BMSCs-NC 组、低氧+BMSCs-NC、低氧+BMSCs-IGF-1、低氧+BMSCs-IGF-1-si-SFRP2、低氧+BMSCs-IGF-1-siNC 组。MTS 检测显示低氧条件下,BMSCs-IGF-1-si-SFRP2组细胞活性明显较BMSCs-IGF-1-siNC组减弱(P<0.01)。Transwell检测发现BMSCs-IGF-1-si-SFRP2组迁移能力明显弱于BMSCs-IGF-1-siNC 组(P<0.01)。Western blot 结果表明,BMSCs-IGF-1-si-SFRP2组的β-catenin、cyclin D1 和 c-Myc 表达水平显著低于 BMSCs-IGF-1-siNC 组。此外,BMSCs-IGF-1组与BMSCs-NC组相比,BCL-2水平增加,BAX水平降低,而si-SFRP2干预则明显逆转这一效果。3.BMSCs-IGF-1保护H9C2大鼠心肌细胞对抗低氧引起的损伤3.1 MTS试剂盒检测细胞增殖情况:相比常氧条件,低氧明显抑制H9C2细胞增殖(P<0.01)。与BMSCs-IGF-1的共培养明显恢复了 H9C2细胞的增殖能力。3.2 Annexin V-FITC染色法检测H9C细胞的凋亡水平:与BMSCs-IGF-1共培养的H9C2细胞中,低氧诱导的凋亡细胞数量(14.52±1.58%)明显少于培养基对照组(35.2±5.02%)(P<0.01);此外,与BMSCs-IGF-1共培养组相比,BMSCs-NC组的H9C2细胞因低氧诱导的凋亡细胞数量减少未能达到统计学意义(22.33±2.29%)。3.3 Western blot 检测细胞凋亡相关蛋白 cleaved caspase-3、BAX、BCL-2 的表达发现:低氧条件下,H9C2细胞中的BCL-2表达降低,而BAX及cleaved caspase-3表达增加(P<0.01)。而当BMSCs-IGF-1与H9C2细胞共培养时,低氧条件下H9C2细胞的cleaved caspase-3、BAX、BCL-2表达水平与在常氧下的H9C2细胞表达情况相似。相比之下,低氧条件下BMSCs-NC与H9C2细胞共培养时,H9C2的BCL-2表达上调程度及BAX和cleaved caspase-3表达下调程度均较轻微,未能达到统计学差异(P>0.05)。4.BMSCs-IGF-1细胞移植改善心肌梗死预后4.1 Masson染色显示,与对照组相比,BMSCs-NC移植减少了心肌梗死后纤维化区域,BMSCs-IGF-1移植进一步减少了心肌纤维化面积。4.2 TUNEL和免疫组织化学方法(immunohistochemistry,IHC)检测表明,BMSCs-IGF-1移植组中大鼠心肌中的细胞凋亡数量低于BMSCs-NC组和对照组。同时,Western blot检测发现BMSCs-IGF-1移植组与BMSCs-NC移植组相比,心脏中cleaved caspase-3和BAX水平降低(P<0.01),而BCL-2水平升高(P<0.001)。结论:与BMSCs-NC相比,BMSCs-IGF-1在低氧条件下具有更高的细胞增殖和迁移能力,更强的细胞干性和抗凋亡能力,以及对心肌细胞更强的保护作用。BMSCs-IGF-1的移植可以改善SD大鼠MI后的心肌细胞凋亡和心肌纤维化。这些作用是由AKT/SFRP2/β-catenin信号轴介导的,并且在此过程中,SFRP2可能起到了经典Wnt/β-catenin信号通路的激动剂而非拮抗剂的作用。